選擇性COX-2抑制劑尼美舒利對人卵巢癌細胞株移植瘤生長的不同影響

石 琪，張科榮，王 平

(1.四川大學華西第二醫院婦產科，四川 成都 610041；2.川北醫學院附屬醫院婦產科，四川 南充 637000)

近年來，臨床、基礎及循證學研究均有證據支持非甾體抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDS)，即環氧合酶(cyclooxygenasa,COX)抑制劑，特別是選擇性COX-2抑制劑可降低卵巢癌的風險及抑制卵巢癌細胞株的生長、侵襲和轉移[1-3]，但也有研究指出應用NSAIDS和降低卵巢癌風險沒有相關性[4-5]，因此是否能應用COX抑制劑防治卵巢癌頗具爭議。對NSAIDS抗癌機制尚不清楚，但其的基本藥理作用是抑制COX活性，因此當腫瘤組織不表達COX，尤其是COX-2時，NSAIDS是否仍然具有抗腫瘤潛能，是否就此造成了在卵巢癌研究中結論的多樣性，亟待探究。本研究初步探討了選擇性COX-2抑制劑尼美舒利(Nimesulide)對COX-2表達不同的人卵巢癌組織的影響，以期了解腫瘤的COX-2表達譜情況是否影響其抑制劑的抗腫瘤潛能。

1 材料與方法

1.1 材料和實驗動物

Balb/c小鼠(nu-/nu-)，雌性，6～8周齡，19～24 g，24只，購自四川大學華西醫學中心實驗動物中心。人卵巢腺癌SKOV-3細胞株由四川大學華西醫學中心免疫教研室提供；人卵巢腺癌OVCAR-3細胞株購自中國科學院上海生科學院細胞資源中心。Nimesulide粉劑，購自Sigma公司。hVEGF-ELISA試劑盒，購自上海晶美生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 SKOV-3及OVCAR-3細胞分別置于含10%熱滅活新生小牛血清、青霉素100 000 U/L、鏈霉素100 mg/L及含20%熱滅活類胎牛血清、0.01 mg/mL牛胰島素、青霉素100 000 U/L、鏈霉素100 mg/L的RPMI1640細胞培養液中，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度恒溫密閉條件下傳代培養。SKOV-3細胞呈片狀貼壁生長，傳代周期2～3 d；OVCAR-3細胞呈島片狀貼壁生長，傳代周期約5～7 d。

1.2.2 建立荷瘤小鼠模型 準備預試驗BALB/c雌性小鼠4只，試驗小鼠20只，約6～8周齡，檢疫1周，無異常。按上述培養條件培養觀察細胞，當細胞數≥5×107個后將其消化，收集于離心管中離心(1 000 rpm、5 min)無血清培養基洗滌2次，同上離心；常規0.4%苔盼藍染色計數，將活細胞數調制3×107mL。將細胞懸液接種于各預試小鼠右側腋窩皮下組織內，0.2 mL/只；觀察小鼠精神、食納、睡眠等一般情況及游標卡尺測量腫瘤生長情況。當腫瘤長至接近2 cm×2 cm大小時，脫頸法處死小鼠，無菌條件下剝出腫瘤，兩種腫瘤各分為10份，每份大小約0.5 cm×0.5 cm，植入試驗小鼠右腋皮下。

1.2.3 分組治療實驗 分組：將植入相同腫瘤的小鼠按隨機表法分為治療組和對照組，每組5只，分籠飼養；治療組給予尼美舒利1.5 mg/kg[8]溶于2%DMSO-PBS(pH=7.2)0.1 mL中，腹腔注射(IP)，每日一次(qd)，共3周；對照組給予2%DMSO-PBS(pH=7.2)0.1 mL，IP，qd×3周。開始實驗干預后，每3 d游標卡尺測量移植瘤的最長徑和最短徑，計算近似體積，繪制移植瘤生長曲線；觀察小鼠一般情況及有無腹瀉、嘔吐、咯血等情況；3周試驗期滿后，脫頸法處死小鼠，剝出腫瘤，游標卡尺測量腫瘤長、寬、高度，計算腫瘤體積及抑瘤率；各取100 mg腫瘤組織于-70 ℃低溫冰箱凍存。

2 結果

2.1 各組小鼠移植瘤腫瘤大小比較、生長狀況及抑瘤率

SKOV-3組：治療組實驗結束后的腫瘤體積為(1.026 4±0.34)cm3；對照組實驗結束后的腫瘤體積為(1.668 2±0.94)cm3。兩者比較無統計學意義(P=0.19)。生長曲線如圖1。可見兩組的腫瘤生長曲線沒有顯著分離。OVCAR-3組：治療組和對照組移植瘤體積的比較：治療組實驗結束后的腫瘤體積為(0.139 6±0.061)cm3；對照組實驗結束后的腫瘤體積為(0.263 4±0.056)cm3；兩者比較有統計學差異(P=0.01)。生長曲線如圖2。尼美舒利干預后腫瘤生長被抑制，抑制率為56.3%，如表1。

表1 尼美舒利干預后OVCAR-3組腫瘤抑制率

實驗分組動物數(n)開始結束平均瘤體積(cm3)開始結束抑瘤率(%)治療組550.0410.13956.3對照組550.0390.263

2.2 各組腫瘤組織內VEGF含量的比較

SKOV-3組:治療組腫瘤的VEGF含量為(1 481.1±235.61)pg/mL；對照組腫瘤的VEGF含量為(1 648±179.02)pg/mL；兩者比較無統計學意義(P=0.09>0.05)。OVCAR-3組：治療組腫瘤的VEGF含量為(1 070.4±578.29)pg/mL；對照組腫瘤的VEGF含量為(1 641.3±541.84)pg/mL；兩者比較有統計學差異(P=0.04)，如表2。

表2 尼美舒利干預后各組腫瘤組織內VEGF含量的比較

3 討論

在婦科腫瘤領域，卵巢癌的死亡率最高，預后最差，在多種治療方法的作用下，五年生存率僅為30%。尋找新的治療方法達到防治的目的是迫切需要解決的問題。雖然大部分循證學和臨床試驗研究支持應用COX抑制劑防治多種癌癥和心腦血管疾患，但在與卵巢癌發病風險的研究中結論尚不統一[1,4,7]。在Guido E.Eibl醫生的研究小組發現COX-2抑制劑尼美舒利能夠刺激不表達COX-2的人胰腺癌細胞系的腫瘤生長，而不是抑制，并且還可刺激其血管生長，對COX-2表達陽性的人胰腺癌細胞系則可發揮抑制作用[8]。類似的機制是否也發生在卵巢癌中，尚無相關報道，本實驗首次初步探討了COX-2表達譜不同的情況下，選擇性COX-2抑制劑的不同抗腫瘤潛能。

應用腫瘤體積為觀察指標，根據每個測量時間點的腫瘤平均體積繪制各組腫瘤的生長曲線(圖1、圖2)，可發現尼美舒利在干預OVCAR-3組時，該組內治療組和對照組腫瘤的生長曲線逐漸相互分離，實驗結束后兩組腫瘤大小有統計學意義(P=0.01)，并可計算出抑瘤率為56.3%。提示尼美舒利的干預在COX-2表達陽性的OVCAR-3組內對腫瘤的大小、生長有抑制作用。SKOV-3組中，治療組和對照組的腫瘤生長曲線沒有顯著分離，實驗結束后兩組腫瘤大小沒有統計學差異，提示尼美舒利的干預在COX-2表達陰性的SKOV-3組內對腫瘤的大小、生長無顯著抑制作用。

關于COX-2的具體致癌機制尚不完全明確，其中大部分機制是基于COX-2產生的PGE2有致癌作用[9-10]，如PGE2能刺激腫瘤組織內各種間質細胞產生血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)[11]。COX-2抑制劑的抗腫瘤機制則主要通過抑制COX-2酶活性而實現。本實驗進一步研究了腫瘤組織內的VEGF水平。結果顯示在OVCAR-3組內，治療組腫瘤組織的含量顯著低于對照組(P=0.04)。提示尼美舒利可能通過抑制COX-2表達陽性的人卵巢癌OVCAR-3移植瘤組織產生VEGF，參與抑制腫瘤的生長、發展，進一步支持實驗中對OVCAR-3組腫瘤生長的觀察結果。在SKOV-3組內，治療組和對照組腫瘤組織的VEGF含量沒有統計學差異，與SKOV-3組腫瘤生長的觀察結果一致，因此尚沒有證據支持尼美舒利能抑制COX-2表達陰性的人卵巢癌SKOV-3移植瘤組織產生VEGF，進而影響腫瘤的生長。選擇性COX-2抑制劑尼美舒利在COX-2表達譜不同的卵巢腫瘤組織中表現出的抗腫瘤潛能是不同的。

本實驗采用安全范圍內高劑量尼美舒利進行干預，根據Eibl等研究提示[8]高劑量的尼美舒利能增加COX-2表達+/-胰腺癌細胞產生的VEGF產量。在陰性細胞株中，這種作用與腫瘤增長及促血管形成相關。在陽性細胞株里，其作用與其對腫瘤內非惡性細胞產生的VEGF的減少作用相抵消，表現為抑制腫瘤生長和血管形成。本實驗尚未發現選擇性COX-2抑制劑對COX-2表達陰性的卵巢癌組織有促進生長的作用，但實驗結果已提示選擇性COX-2抑制劑對COX-2表達陰性的卵巢癌組織沒有顯著抑制作用，這為應用COX-2抑制劑在卵巢癌的研究中結論的多樣性提供了一定理論基礎，其機理有待進一步研究。

綜上所述，在對腫瘤防治的研究中，選擇性COX-2抑制劑有傳統腫瘤治療藥物不可比擬的優點：(1)COX-2抑制劑可口服、可長期堅持、副反應??；(2)對多種腫瘤有一定的預防作用，這對一些有明顯腫瘤高發傾向的人群無疑有很好的保護作用；(3)可與手術、放化療等傳統腫瘤治療手段聯合應用，提高腫瘤對放化療的敏感性，延長腫瘤患者的生存期[12]；(4)COX-2在腫瘤及相關疾患中的新角色、新作用正在不斷發現，頗具研發前景[10]。但腫瘤的發生發展是一個多基因、多因素、多步驟的復雜過程，也就意味著腫瘤本身存在多樣性，不同腫瘤和不同的個體對藥物的反應都有其特異性。包括本研究在內的相關研究均存在異質性結論[13]，提示COX-2抑制劑是否適用于各種腫瘤，包括同一種腫瘤的不同亞型，還有待商榷。在選用COX-2抑制劑防治卵巢癌時，有可能需要篩查腫瘤細胞表達COX-2的情況。

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