多種糖類添加物對秘魯魷魚(Loliginidae)肌原纖維蛋白抗凍保水效果及構象變化影響研究*

丁 晨 謝 超 張 賓 林 琳 馬路凱

(浙江海洋學院食品與醫藥學院 舟山 316022)

秘魯魷魚(Peru squid)屬軟體動物, 也稱槍烏賊(Loliginidae), 其肉質香甜細膩, 質地上乘。秘魯魷魚胴體中蛋白質含量在16%—20%之間, 且富含人體必需的多種氨基酸, 且脂肪含量低, 是一種營養豐富、高蛋白、低脂肪的營養保健型水產品資源(何蕓等,2007)。近年來, 國內外專家采用多種方法對魚肉蛋白冷凍變性進行了深入研究。研究表明, 在凍藏期間內,隨著時間的增長, 冷凍變性之后的魷魚肌動球鹽溶性蛋白、Ca2+-ATPase活性和總巰基含量均顯著下降,且溫度越高下降越快(汪秋寬等, 1997)。通?？勺鳛轸~糜蛋白抗凍保水劑的糖類物質主要有蔗糖、山梨醇、多聚葡萄糖等。薛勇(2006)加入5%的海藻糖類作為抗凍保水劑, 檢測凍藏后鳙魚Ca2+-ATPase活性、肌原纖維蛋白含量、總巰基含量等的變化, 并與商業抗凍保水劑進行比較, 結果表明海藻糖類具有更好的抗凍保水效果(劉慶慧等, 1999)。海藻糖(trehalose)是一種天然、安全、無毒無害的白色晶體, 理化性質極其穩定, 能更好地有效保護蛋白質的天然結構不受破壞, 防止蛋白質在冷凍時的變性(劉海梅等, 2008;農業部漁業局, 2010; 周愛梅等, 2010), 國內外學者已將海藻糖類抗凍保水效果在海水魚糜領域進行了一部分研究, 而在其種類和添加濃度方面深入研究較少, 目前已確認的最適添加濃度在0.5%—2.0%之間(李艷青, 2004; 薛勇, 2006; 焦道龍, 2010), 本文研究的目的就是在最適濃度范圍內通過添加多種不同海藻糖類物質, 通過對魷魚魚糜各項理化指標的檢測和對比, 來篩選出最佳海藻糖類及其濃度值, 從而最大程度地提高秘魯魷魚肌原纖維蛋白的抗凍特性及保水特性, 以期為提高凍藏魷魚魚糜制品品質提供理論基礎和應用指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗材料: 凍品秘魯魷魚魚糜購于舟山市水產品批發市場; 將新鮮魚糜加入冰塊, 30min運回實驗室。

主要試劑: 海藻糖(C12H22O11)海藻膠[(C6H7NaO6)n,32—200 kDa]、海藻膠寡糖(500—600 Da)、焦磷酸鈉(Na4P2O7)含量均＞99%, 食品級; Tris馬來酸、三羥甲基氨基甲烷、牛血清蛋白、亞硫酸氫鈉及米吐爾, 分析純等, 以上試劑均購于沃凱化學試劑有限公司。

主要儀器與設備: FJ200-SH型勻漿機(上海標本模型廠); U32V型超低溫冰箱(上海三洋電器制造有限公司); UV-2600型分光光度計(日本日立電子產品有限公司)。

1.2 實驗分組及處理

實驗分組: (1) 0.5%海藻糖溶液; (2) 1.0%海藻糖溶液; (3) 1.5%海藻糖溶液; (4) 2.0%海藻糖溶液; (5)0.5%海藻膠溶液; (6) 1.0%海藻膠溶液; (7) 1.5%海藻膠溶液; (8) 2.0%海藻膠溶液; (9) 0.5%海藻膠寡糖溶液; (10) 1.0%海藻膠寡糖溶液; (11) 1.5%海藻膠寡糖溶液; (12) 2.0%海藻膠寡糖溶液; (13) 0.5%焦磷酸鈉溶液; (14) 1.0%焦磷酸鈉溶液; (15) 1.5%焦磷酸鈉溶液;(16) 2.0%焦磷酸鈉溶液 (前期研究發現, 0.5%—2.0%磷酸鹽類起到的保水抗凍效果最好, 因此選擇此濃度范圍進行比較研究, 以確定篩選最適海藻糖種類及添加量。以上濃度均為質量濃度)。

實驗處理: (1) 解凍: 首先, 取出冷凍魷魚魚糜,在4°C冰箱內進行過夜解凍。(2) 分裝: 按照以上各處理組進行添加處理。注意每組樣品加入指定濃度的糖類添加物后, 攪拌勻漿機分散均勻后, 再進行分裝。每個小封口袋中裝入約50g樣品, 每組樣品7袋。分裝好的樣品, 同組裝入1個大的封口袋中, 注意每大封口袋標明樣品組編號。(3) 速凍: 將封裝好的樣品置于–55°C超低溫冰箱中凍結3h。隨后取出, 置于–18°C的冰箱中長期貯藏。(4) 取樣: 每隔7天取樣1次, 即取樣時間為0、7、14、21、28、35、42天取樣1次, 每次取樣1個小封口袋(50g魚糜進行測定以下指標)。

1.3 實驗內容及方法

1.3.1 解凍損失率(曾名勇等, 2003) 冷凍魷魚魚糜解凍損失率(%) = (M1–M2) /M1×100。

1.3.2 鹽溶性蛋白含量(潘錦鋒等, 2008) 取5.0g魷魚魚糜樣品, 加入30.0mL高鹽緩沖液(0.5mol/L KCl, 0.01mol/L NaH2PO4, 0.03mol/L Na2HPO4), 25°C振蕩4h, 4°C提取16h, 經5000r/min離心10min(4°C),采用Folin酚法測定上清液蛋白質含量。

1.3.3 肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性(曲楠等, 2010)制備反應混合液含pH 7.0, 0.05mol/L Tris-順丁烯二酸緩沖液、0.10mol/L CaCl2、H2O、pH 7.0, 20mmol/L ATP溶液和肌原纖維蛋白溶液。將以上反應混合液置于25°C水浴10min, 加入1.0mL 15% TCA溶液終止反應。空白對照在反應前加入1.0mL 15% TCA溶液,使蛋白質變性。反應結束后, 取1.0mL反應溶液, 分別加入0.5mL米吐爾、1.0mL硫酸鉬酸和2.5mL水,混勻后室溫發色50min, 在640nm下測定吸光值。標準曲線繪制以0.5mmol/L KH2PO4作為標準。Ca2+-ATPase活性計算公式: 活性 = (A–B) /t×酶蛋白量。式中:A為1.0mL反應液中生成的磷酸量(μmol);B為空白值(μmol);t為反應時間(min); 酶蛋白量為1.0mL反應液所含酶量(mg)。

1.3.4 肌原纖維蛋白總巰基含量(羅永康等, 1996)取1.0mL肌原纖維蛋白溶液, 加入9.0mL 0.2mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 6.8, 含8mol/L尿素, 2% SDS,10mmol/L EDTA)。充分混勻后取出4.0mL, 加入0.4mL 0.1% DTNB溶液(0.2mol/L, pH 8.0 Tris-HCl緩沖液), 然后置于40°C水浴25min, 最后在412nm下測定吸光值, 空白對照采用0.6mol/L KCl溶液代替?？?SH(總巰基)含量計算公式: CO =A×D/ξ×C。其中: CO為-SH摩爾濃度;A為412nm處吸光值;D為稀釋倍數;ξ為分子吸光系數13600/(mol?cm/L);C為蛋白質濃度(mg/mL)。

1.3.5 數據分析 數據處理及作圖采用Origin 8.2、SPSS 13.1統計分析軟件, 結果為平均值±標準方差。

2 結果與討論

2.1 秘魯魷魚魚糜解凍水分含量損失率變化

新鮮魷魚魚糜在凍藏過程中, 細胞內冰晶的形成使肌肉蛋白受到壓縮、凝結而變性, 同時破壞了細胞膜結構, 導致解凍過程中細胞內部汁液滲透溢出(劉海梅等, 2007)。添加不同海藻糖類抗凍保水劑對冷凍魷魚魚糜解凍水分損失率的影響, 如表1所示。隨著貯藏時間延長, 蒸餾水組(空白)處理魷魚魚糜解凍后, 出現較大程度汁液流失(損失率8.85%—10.60%)。海藻膠組(0.5%—2.0%)處理魷魚魚糜, 解凍水分損失率(8.57%—10.58%)略低于空白組, 但二者并無顯著性差異(P＞0.05), 表明大分子海藻膠溶液(32—200 kD)無法有效滲入到肌肉間隙, 對魷魚魚糜抗凍、保水性基本無影響。海藻糖組(0.5%—2.0%)(342 Da)處理顯著降低了冷凍魚糜解凍水分損失率(7.12%—7.87%,P＜0.05), 且1.0%濃度組處理效果最好。海藻膠寡糖組(0.5%—2.0%)(500—600 Da)處理較空白處理, 也能顯著降低冷凍魷魚魚糜解凍汁液流失(7.24%—7.98%), 其與焦磷酸鈉組(0.5%—2.0%)抗凍保水效果(7.02%—7.59%)無顯著性差異(P＜0.05), 效果也較好。關于海藻糖抗凍保水機制, 一種解釋是因為海藻糖分子同魷魚魚糜肌肉蛋白質相結合形成了一種類似冰晶狀的玻璃體結構, 使蛋白質分子在空間結構上更加趨于穩定, 從而在凍藏時對魷魚魚糜肌原纖維蛋白起到保護作用(丁玉庭等, 1999)。

表1 不同抗凍保水劑對于凍藏過程中秘魯魷魚魚糜解凍損失率的影響Tab.1 Effect of different antifreeze agents on the thawing loss of Peru squid minced fillet during storage

2.2 秘魯魷魚魚糜肌原纖維鹽溶性蛋白含量變化

蛋白質鹽溶性是反映肌肉蛋白質變性的常用理化指標(反映肌球蛋白桿部的變化性質), 魷魚魚糜在凍藏過程中, 肌原纖維蛋白質中氫鍵、二硫鍵和疏水鍵的形成往往導致蛋白質鹽溶性含量下降(高瑞昌,2007)。不同海藻糖類抗凍保水劑及其濃度值對于凍藏魷魚魚糜中肌原纖維鹽溶性蛋白含量的影響, 如圖1所示。新鮮魷魚魚糜中鹽溶性蛋白含量為100.53 mg/g; 隨著凍藏時間延長, 各種海藻糖類處理方式下的冷凍魷魚魚糜肌原纖維鹽溶性蛋白含量均呈下降趨勢。其中, 在對四種海藻糖類各自不同濃度的比較中均以濃度為2.0%條件下處理的魷魚魚糜鹽溶性蛋白下降程度最大, 6周后含量依次為41.26、29.18、38.74和31.37mg/g (P＞0.05), 而均以濃度為1.0%條件下處理的魷魚魚糜下降程度最小, 6周后含量依次為53.57、42.26、49.14和45.52mg/g。而在濃度同為1.0%條件下, 四種海藻糖類中又以海藻糖組對魷魚魚糜肌原纖維鹽溶性蛋白含量降低抑制作用最為顯著, 海藻膠寡糖組次之。研究表明, 引起冷凍魷魚魚糜肌肉鹽溶性蛋白含量下降的原因很多, 如肌肉蛋白質中的自由水、結合水凍結成冰晶析出, 蛋白質分子間形成非共價鍵而凝聚, 蛋白質中巰基被氧化形成二硫鍵導致肌球蛋白重鏈的聚合等, 從而降低鹽溶性蛋白的溶解性(Benjakulet al, 1997)。上述結果表明, 無任何抗凍保水劑的魷魚魚糜蛋白質在凍藏過程中發生了較強的變性作用, 且凍藏時間越長變性程度越加嚴重, 而海藻糖、海藻膠寡糖等抗凍保水劑的添加,則可在很大程度上抑制其冷凍變性, 提高凍藏穩定性, 從而保持冷凍魷魚魚糜制品的品質。

2.3 秘魯魷魚魚糜肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性變化

圖1 秘魯冷凍魷魚魚糜鹽溶性蛋白含量在四組不同糖類添加物作用下凍藏過程中的變化Fig.1 Effect of different antifreeze agents on the content of salt-soluble protein in Peru squid minced fillet

Ca2+-ATPase活性也可反映肌肉肌球蛋白的變性程度, 其表征的是肌球蛋白頭部的變化特征, 其活性大小也被廣泛用作蛋白質變性的評價指標(Katohet al, 1997)。不同抗凍保水劑對于凍藏魷魚魚糜肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的影響, 如圖2所示。由結果可知, 隨著凍藏時間延長, 各海藻糖類處理組魷魚魚糜肌原纖維Ca2+-ATPase活性均呈下降趨勢(P＜0.05)。凍藏6周過程中, 同一時期, 在對四種海藻糖類各自不同濃度的比較中均以濃度為2.0%條件下處理的魷魚魚糜Ca2+-ATPase活性下降程度最大, 6周后含量依次為0.142、0.108、0.118和0.113μmol Pi/(mg min)(P＞0.05), 而均以濃度為1.0%條件下處理的魷魚魚糜下降程度最小, 6周后含量依次為0.172、0.131、0.165和0.153μmol Pi/(mg min)。而在濃度同為1.0%條件下, 四種海藻糖類中又以海藻糖組對魷魚魚糜Ca2+-ATPase活性下降的抑制作用最為顯著, 海藻膠寡糖組次之。有研究認為, 肌肉蛋白Ca2+-ATPase活性的喪失是由于肌肉組織內部冰晶和離子強度的增加、pH下降、ATPase三級結構發生了改變等導致的(MacDonaldet al,1994)。而海藻糖、海藻膠寡糖的加入, 顯著抑制了魷魚魚糜肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性下降, 該結果也符合冷凍魷魚魚糜肌原纖維蛋白含量的變化情況。

2.4 秘魯魷魚魚糜肌原纖維蛋白總巰基含量變化

圖2 秘魯冷凍魷魚魚糜肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性在四組不同糖類添加物作用下凍藏過程中的變化Fig.2 Effect of different antifreeze agents on the myofibrillar protein activity of Ca2+-ATPase in Peru squid minced fillet

總巰基含量也是反映肌原纖維蛋白變性的常用理化指標, 在凍藏過程中, 隱藏在蛋白質分子中的活性巰基被逐漸暴露, 并氧化成二硫鍵, 導致肌原纖維蛋白總巰基含量發生變化(Smythet al, 1996)。不同抗凍保水劑對于凍藏魷魚魚糜中總巰基含量的影響,如圖3所示。新鮮魷魚魚糜中肌原纖維蛋白總巰基含量為6.052mol/105g, 隨著凍藏時間延長, 各海藻糖類處理方式下的冷凍魷魚魚糜總巰基含量均顯著下降,凍藏6周過程中, 同一時期, 在對四種海藻糖類各自不同濃度的比較中, 均以濃度為2.0%條件下處理的魷魚魚糜總巰基含量下降程度最大, 6周后含量依次為4.269、3.955、4.225和4.067mol/105g (P＞0.05), 而同樣, 均以濃度為1.0%條件下處理的魷魚魚糜下降程度最小, 6周后含量依次為4.902、4.428、4.876和4.702mol/105g。而在濃度同為1.0%條件下, 四種海藻糖類中又以海藻糖組對魷魚魚糜總巰基含量下降的抑制效果最好, 海藻膠寡糖組次之。研究表明, 引起冷凍魷魚魚糜肌原纖維蛋白總巰基含量下降的原因很多, 如肌原纖維蛋白分子間相互聚集和交互作用,使SH被氧化成二硫鍵, 形成穩定的空間三維結構, 從而降低肌原纖維蛋白抗氧化性等(Somjitet al, 2005)。上述結果表明, 無任何抗凍保水劑的魷魚魚糜在凍藏過程中肌原纖維蛋白總巰基發生了較大程度的下降, 且凍藏時間越長下降越多, 而海藻糖、海藻膠寡糖等抗凍保水劑的添加, 則可在很大程度上抑制其氧化變性, 提高抗氧化性和凍藏穩定性, 從而保持冷凍魷魚魚糜制品的品質。

3 結論

以秘魯魷魚魚糜為研究對象, 以蒸餾水和焦磷酸鈉浸泡處理為對照組, 研究了海藻糖、海藻膠寡糖及海藻膠對于冷凍魷魚魚糜肌肉蛋白質變性特征的影響情況。結果表明, 添加濃度為1.0%的海藻糖、海藻膠寡糖有效的降低了冷凍魷魚魚糜的解凍汁液流失, 同時在一定程度上減緩了魷魚魚糜肌原纖維鹽溶性蛋白、Ca2+-ATPase活性、總巰基含量下降等劣變現象, 保持了冷凍魷魚魚糜的品質, 其中以1.0%的海藻糖作用效果最為顯著。由此可見, 海藻糖、海藻膠寡糖的開發與利用, 可作為一種較好的冷凍水產品復合磷酸鹽的替代品。

圖3 秘魯冷凍魷魚魚糜肌原纖維蛋白總巰基含量在四組不同糖類添加物作用下凍藏過程中的變化Fig.3 Effect of different antifreeze agents on the myofibrillar protein of total thiols in Peru squid minced fillet

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