舟山海域一株產堿性蛋白酶海洋放線菌的鑒定、選育及發酵條件的初步研究*

李 鵬 苗增良 王健鑫

(浙江海洋學院海洋科學與技術學院 舟山 316022)

堿性蛋白酶(Alkaline protease)是指在pH在堿性條件下水解蛋白質肽鍵的酶類, 廣泛存在于動、植物及微生物體中, 是一類非常重要的工業用酶。堿性蛋白酶應用很廣泛, 在洗滌劑、絲綢、飼料、飼料、制革、食品、醫藥、環保等領域廣泛應用(Bhaskaret al,2007; Wanget al, 2008; Jellouliet al, 2009), 在全世界范圍內占工業酶制劑市場的65%以上(Baniket al,2004), 具有很重要的工業和經濟價值(Guptaet al,2002)。微生物由于生長速度快、生長條件較簡單、代謝過程特殊等特點, 使之成為蛋白酶的重要來源。微生物蛋白酶均為胞外酶, 其從微生物中提取, 不受資源、環境和空間的限制, 具有動物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比擬的優越性(梅承芳等, 2005)。

目前對堿性蛋白酶的研究主要集中在3個方面:通過誘變、培養條件優化、異源表達等提高酶產量;分子結構研究和定點、定向突變以提高酶的性能; 篩選新型堿性蛋白酶和產酶菌株。在篩選新型堿性蛋白酶和產酶菌株方面, 近年來已報道了具有較高pH適應性的堿性蛋白酶(郝建國等, 2010), 水解多種底物的堿性蛋白酶(肖昌松等, 2001), 堿性彈性蛋白酶(Kumaret al, 1999), 具有耐表面活性劑、耐熱、耐氧化劑等特性的堿性蛋白酶等(Banerjeeet al, 1999;Johnveslyet al, 2001)?，F階段所報道的產酶菌株主要為芽孢桿菌屬(Bacillus)。堿性蛋白酶仍然存在品種單一的問題, 酶的活性不高, 價格昂貴等不足, 加上各國都十分注重對已有的重要微生物資源的保護, 使得優質產酶菌株的篩選和選育有著十分重要的研究前景。

海洋微生物與陸生微生物相比其生存環境更加惡劣, 如高滲、低溫、高壓、低營養等, 也造就其獨特的代謝途徑, 因此海洋微生物所產蛋白酶可能具有更加獨特的酶學性質和構造。

Sreeja等(2011)從海洋微生物Engyodontium albumBTMFS10中分離到堿性絲氨酸蛋白酶, 該酶除了具有很好的耐高溫(60°C酶活最高)、嗜堿(pH 11時酶活最高)以外, 還具有很好的穩定性, 如其在烴類、天然油脂、表面活性劑及大部分的有機溶劑中均表現很好的穩定性, 在洗滌劑工業具有很好的應用前景。

Anjali等(2014)從海洋微生物Bacillus tequilensisP15中發現耐受絕大部分有機溶劑的堿性蛋白酶, 試驗結果顯示該酶對于去除衣物上的血漬、脫毛及除去感光膠片上的明膠具有很好的效果。

國產堿性蛋白酶主要在酶活、成本和酶學性質等方面不能滿足工業發展的要求, 大規模工業用堿性蛋白酶主要還依賴于進口, 希望通過本次試驗研究,能發現高產蛋白酶的海洋微生物, 并為下一步的研究, 如: 發酵條件的優化、蛋白酶基因的克隆、工程菌的構造等方面的研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

分別在浙江舟山的三江碼頭、鴨蛋山碼頭、東極島、朱家尖、東港等地的潮間帶采集海水、海泥。

1.1.1 培養基

(1) 高氏一號改良培養基: 可溶性淀粉20g,KNO31g, K2HPO40.5g, MgSO4?7H2O 0.5g, NaCl 0.5g,FeSO40.01g, 瓊脂20g, 人工海水1000mL, pH 7.4—7.6。

(2) 脫脂奶培養基(沈萍等, 1999): 牛肉膏5.0g,蛋白胨10.0g, 氯化鈉1.0g, 瓊脂20.0g, pH值7.2—7.4,加熱溶解于海水中, 121°C高壓滅菌20min, 備用。脫脂牛奶10.0g, 溶解于海水中, 115°C滅菌30min。兩者在無菌環境下混勻得到1000mL的培養基。

(3) 酪素瓊脂改良培養基: 酪蛋白4g, CaCl20.002g, MgSO4?7H2O 0.5g, K2HPO4?7H2O 1.07g, KH2PO40.36g, ZnCl20.014g, NaCl 0.16g, FeSO40.0002g, 水解干酪素0.05g, 瓊脂18g, 人工海水1000mL, pH 8.0。

(4) 放線菌發酵培養基, 分別記為1—6號:

① 淀粉5g, 黃豆粉10g, KH2PO41g, 人工海水1000mL, pH 8.5。

② 胰蛋白胨10g, 酵母膏5g, 玉米粉5, Na2HPO4?12H2O 4g, KH2PO40.3g, Na2CO31g, 人工海水1000mL,pH 8.5。

③ 酪蛋白10.0g, 牛肉膏3.0g, NaCl 5.0g, K2HPO42.0g, 人工海水1000mL, pH 8.5。

④ 可溶性淀粉4.0%, 酵母膏0.5%, 牛肉膏1.0%蛋白胨1.5%, NaCl 0.5%, K2HPO40.35%, NaH2PO40.03%, Na2CO30.056%, 人工海水1000mL, pH 8.5(沈萍等, 1999)。

⑤ 蛋白胨5.0g, 酵母膏3.0g, 葡萄糖5.0g, 人工海水 1000mL, pH 8.5 (周德慶, 2006)。

⑥ 牛肉膏5.0g, 蛋白胨10.0g, NaCl 1.0g, 脫脂奶10.0g, 人工海水1000mL, pH 8.5。

1.1.2 實驗試劑 細菌基因組DNA提取試劑盒(TIANamp BacteriaDNA Kit)由天根生化科技(北京)有限公司提供, 常規化學試劑DNA Marker購自TaKaRa公司, 其余均購于國藥集團。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的分離與純化 將采樣得到的潮間帶海泥進行梯度稀釋, 在高氏I號培養基平板上涂布培養, 按照菌落形態、大小、顏色等不同挑選單菌落在高氏I號培養基平板上劃線, 倒置25°C培養3—5d,繼續挑取單菌落, 重復劃線。重復上述步驟2—3次,共得到純菌株50株。

1.2.2 目標菌株的篩選 將分離純化得到的放線菌在脫脂奶平板上進行點種, 25°C培養, 觀察有無透明圈的產生。

1.2.3 酶活測定 將篩選到的菌株接種于放線菌發酵培養基50/250mL搖瓶中進行培養, 溫度25°C,轉速120r/min培養3—5d后測酶活。

1.2.3.1 標準曲線的制作 用酪氨酸配置0—100μg/mL的標準溶液, 酪氨酸在275nm下有特征光吸收, 通過建立酪氨酸濃度與該濃度下的酪氨酸在275nm下光吸收關系的標準曲線, 通過紫外分光光度法測定堿性蛋白酶促蛋白質消化反應的生成物在275nm下的吸光度, 就可以計算反應生成酪氨酸的量,根據酶活力的定義計算堿性蛋白酶的活力。按表1制備不同濃度的酪氨酸溶液。

用分光光度計于680nm波長下測各管的光吸收值(A), 進行測量, 用“1”號管作為空白對照, 以于680nm波長下測各管的A值為縱坐標, 每管的酪氨酸含量為橫坐標, 繪制酪氨酸的標準曲線。

1.2.3.2 堿性蛋白酶活力的測定 將目標菌株發酵酶液進行5000r/min離心去除菌體后, 取粗酶液適當稀釋后按照表2進行酶活測定, 每種樣品做2次平行試驗。其中試管1為空白對照。具體步驟見表2。

蛋白酶活力: 以酪蛋白為底物, 每分鐘水解產生1μg酪氨酸的酶量為1個酶活力單位。

式中,Up表示蛋白酶活力,A680表示由樣品測得的吸光度值,K為吸光系數(從標準曲線中得到), 4為反應試劑的總體積, 10為反應時間,n為稀釋倍數。

表1 標準曲線的制作Tab.1 Data for making standard curves

表2 測樣品酶活的步驟Tab.2 Steps of measuring enzyme activity in the samples

1.2.4 菌株形態觀察 利用插片法對目標菌株進行形態觀察。

1.2.5 菌株A20的生理生化試驗 采用不同的糖作為碳源, 對目標菌株的碳源利用情況進行觀察。將篩選得到的目標菌株進行常規項目的生理生化實驗,觀察結果。

1.2.6 菌株A20的16S rDNA分子鑒定 用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取目標菌株的DNA, 以總DNA為模板進行PCR擴增(Kunamneniet al, 2003),PCR產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析, PCR產物純化試劑盒回收1500bp的PCR產物, 產物以Seq Forward、Seq Reverse、Seq Internal為引物進行16S rDNA測序, 測序工作由寶生物工程(大連)有限公司完成。

1.2.7 菌株A20的系統進化樹的繪制 利用Blast對得到的序列在數據庫中進行相似序列的搜索, 獲得與目標菌株相似性較高的菌株(97%以上相似性),對同源性較好的序列進行比對(Clustalx 1.8), 繪制系統進化樹(PhyloDraw V8.0)。

1.2.8 不同發酵培養基對菌株A20的酶活影響分別采用淀粉培養基、胰蛋白胨培養基、蛋白胨培養基等六種培養基進行發酵試驗, 得到最適產酶培養基。

1.2.9 菌株的誘變 先將目標菌株進行紫外誘變, 獲得的高產株再分別進行DES誘變, 獲得最終的高產菌株。

1.2.9.1 紫外誘變 取2mL的菌懸液放入6cm培養皿中, 垂直照射距離為30cm。先蓋蓋子照射1min,打開蓋子照射處理, 同時用磁力攪拌器進行攪拌, 處理時間為30、60、90、120、150、180s。在各個處理時間點將處理的菌液取100μL用無菌生理鹽水進行梯度稀釋, 稀釋至10–3濃度, 取0.1mL在脫脂奶培養基上進行涂布, 3個重復, 同時對未經紫外處理的對照菌液也進行稀釋后平板涂布, 計算致死率, 致死率 =(1－誘變處理后每0.1mL菌落數/對照每0.1mL菌落數)×100%。涂布后的平板在暗處培養3—5d后觀察, 選取HC比值(透明圈直徑/菌落直徑)較對照明顯大的單菌落進行發酵, 25°C, 120r/min, 50mL/ 250mL裝量, 做3個平行, 測其酶活。

1.2.9.2 DES誘變 挑取經紫外誘變后的斜面保種突變菌株于液體高氏1號培養基, 50mL/250mL接種, 25°C、120r/min培養5d。誘變處理將處于對數生長期的菌液在室溫下5000r/min離心10min, 棄上清液, 收集菌體。用10mL 0.1 mol/L 磷酸緩沖液(pH 7.0)洗滌2次, 然后重懸于pH 7.0的磷酸緩沖液中, 調整菌液濃度為108個/mL(調整OD600= 0.5左右即可)。移取4mL菌液到16mL磷酸鉀緩沖溶液(pH 7.0)中,加入0.2mL硫酸二乙酯, 分別振蕩處理10、20、30、40、50、60min, 最后加入0.5mL 25%硫代硫酸鈉中止反應。將誘變處理10、20、30、40、50、60min的菌液稀釋到10–3稀釋度, 做3個重復, 取0.1mL平板涂布, 以未經化學誘變處理的出發菌為對照, 25°C恒溫培養箱中培養5d (邱雁臨等, 2008)。將培養好的平板取出, 菌落計數, 計算致死率。挑取HC比值大的單菌落進行發酵(同時斜面保種), 做3個平行重復,測其酶活。

1.2.9.3 穩定性試驗 將誘變得到的高產菌株連續傳代10代, 測其酶活。

1.2.10 最適溫度的選擇 將誘變得到的菌株分別在28、37、45、50、55、60°C下搖瓶培養, 分別測酶活。

1.2.11 最適pH選擇 將誘變得到的菌株分別接種于pH為7.5、8、8.5、9、9.5、10的發酵培養液中,分別測酶活。

1.2.12 最適培養時間選擇 將誘變得到的菌株分別接種于pH 7.5的發酵培養液中, 28°C分別培養24、36、48、60、72、84、96h。分別測酶活。

2 結果與分析

2.1 篩選結果

得到2株產較大透明圈的菌株, 分別記A8和A20。篩選結果如圖1和圖2所示。透明圈大小情況如表3所示。

2.2 酶活測定結果

圖1 菌株A8平板圖Fig.1 Shape of Strain A8

圖2 菌株A20平板圖Fig.2 Shape of Strain A20

表3 兩株放線菌所形成透明圈直徑大小Tab.3 The size of diameter of transparent zone

2.2.1 標準曲線的制作 用100μg/mL的酪氨酸標準溶液配制標準系列溶液, 在OD680nm處進行測定,并繪制標準曲線。不同含量的酪氨酸的吸光度值結果見表4。

以光吸收值(A)為縱坐標, 酪氨酸含量為橫坐標,繪制酪氨酸的標準曲線, 見圖3?；貧w方程y=0.0088x－0.0111, 相關系數R2= 0.9977, 具有較好的線性關系。

表4 不同含量的酪氨酸吸光度值結果Tab.4 Results of different levels of tyrosine absorbance

圖3 酪氨酸標準曲線Fig.3 Standard curve of tyrosine

2.2.2 目標菌株酶活測定 對菌株A8、A20進行兩組平行測定酶活, 最后取平均值作為最終結果, 如表5所示。

表5 堿性蛋白酶活力測量結果Tab.5 Results of alkaline protease activity

菌株A20的酶活較高, 因此選取菌株A20作為研究對象, 進行紫外線和DES誘變處理以獲得高產菌株。

2.3 菌株A20的形態觀察

利用插片法觀察A20形態, 菌絲呈鏈狀, 斷裂,無卷曲狀分布。顯微觀察結果如圖4所示。

2.4 菌株A20的生理生化試驗

菌株A20在不同培養基條件下的生長3d情況如表6所示, 對不同碳源的利用情況如表7所示, 生理生化結果如表8所示。

由生理生化試驗結果可知, 菌株A20可以利用除了除了鼠李糖之外的常見碳源, 并都能使硝酸鹽還原, 還具有水解淀粉的能力。

圖4 菌株A20顯微觀察圖Fig.4 Hyphal morphology of Strain A20

表6 菌株在不同培養基上培養3d的生長情況Tab.6 Strain A20 in different culture media on the growth after 3d

表7 菌株A20對不同碳源的利用情況Tab.7 Strain A20 on the utilization of different carbon sources

表8 菌株A20的生理生化試驗結果Tab.8 Physiological and biochemical tests on Strain A20

2.5 16S rDNA序列分析結果

16S rDNA分子鑒定結果顯示菌株A20的核苷酸長度為1361bp, 將測序得到的核苷酸序列上傳至NCBI的GenBank數據庫獲得登錄號為GU263841。

2.6 系統進化樹繪制

利用Blast軟件, 從GenBank數據庫中查找同源性較高的菌株, 來構建系統進化樹, 系統進化樹如圖5所示。系統進化樹顯示菌株A20與Streptomyces roseoviridisJS-9(玫瑰綠鏈霉菌)和Streptomyces roseusJS-18(淺玫瑰色鏈霉菌)的進化位置最近, 相似性達99.8%, A20不產水溶性色素, 并在燕麥汁、PDA培養基中培養時產生淺玫瑰色菌落, 菌株A20很可能為一種淺玫瑰色鏈霉菌。

2.7 不同發酵培養基對菌株A20的酶活影響

在1—6號不同發酵培養基培養條件下菌株A20的酶活大小如表9所示。結果顯示1號培養基(淀粉培養基)培養條件下酶活較大。因此誘變均在1號培養基作為發酵培養基條件下進行。

2.8 誘變結果

2.8.1 紫外誘變結果 紫外誘變致死率情況如表10所示, 結果顯示紫外線處理時間應控制在60—150s。

在120s處理的平板上得到HC比值最大的菌株(HC比值為5.3)進行發酵培養, 最終得到酶活為182.8U/mL。相比于初始酶活104.7U/mL, 酶活提高74.6%, 并將得到的菌株進行DES誘變。

圖5 根據16S rDNA序列構建的菌株A20以及相關種、屬的系統進化樹Fig.5 The NJ evolutionary tree based on completed sequence of Strain A20 16S rDNA

表9 堿性蛋白酶活力測量結果Tab.9 Alkaline protease activity measurement results

表10 紫外線誘變結果Tab.10 The result of ultraviolet mutation

2.8.2 DES誘變結果 DES誘變結果致死率如表11所示, 結果顯示處理時間應控制在30—50min。

表11 DES處理結果Tab.11 The result of DES mutation

在處理50min的平板上獲得HC比值最大的菌株(HC比值為5.9), 進行發酵培養, 最終得到酶活為227.5U/mL, 酶活提高51.8%。

2.9 傳代試驗

將DES處理過的酶活為227.5U/mL的A20菌株進行傳代試驗, 轉接種10次, 測試酶活結果如表12所示。

表12 傳代10次的酶活測試結果Tab.12 Results of enzyme activity test after ten times of subculture

連續傳代10代結果顯示酶活最低為第10代的208.9U/mL, 酶活下降8.17%, 酶活下降較少, 誘變后的菌株較為穩定。

2.10 最適溫度

各溫度下酶活測試結果如圖6所示。結果顯示發酵溫度為50°C具有最高酶活, 酶活為227.9U/mL。

2.11 最適pH值

各pH下酶活如圖7所示。結果顯示當pH 9.0時酶活最高。

圖6 最適溫度試驗Fig.6 The optimal temperature test

圖7 最適pH試驗Fig.7 The optimal pH test

2.12 最適培養時間

培養時間為36h之前為菌體生長階段, 此時產酶較少, 酶活較低, 當培養時間超過48h以后, 菌體進入產酶階段, 酶活逐漸增加, 當培養時間為72h時, 酶活最高, 為228.5U/mL。詳見圖8。

圖8 最適培養溫度試驗Fig.8 Testing for the optimal culture time

3 討論

從舟山潮間帶海域中篩選得到產堿性蛋白酶的放線菌菌株A20, 生理生化試驗和16S rDNA分析結果顯示該菌株為Streptomyces roseus, 記為Streptomyces roseusA20, 該菌株在淀粉-黃豆粉發酵培養基中酶活較高, 這可能與黃豆粉屬于慢速利用氮源有關。紫外誘變顯示在處理時間為60—120s, 致死率為76.5%—90.1%時得到正突變株, 此時得到的誘變菌株透明圈明顯較大, 經測定酶活為182.8U/mL, 與初始菌株相比酶活提高74.6%。再經過30—50min DES誘變處理,致死率為68.8%—93.8%時得到正突變株, 酶活為227.5U/mL, 比初始酶活104.7U/mL提高117.3%, 誘變效果較為明顯。傳代試驗顯示突變株具有較好的遺傳穩定性, 在連續傳代10次測定酶活發現該酶酶活無明顯下降。單因素試驗結果顯示在發酵溫度為50°C、pH值為9.0, 培養時間為72h時候酶活最高。

利用物理或者化學方法進行誘變育種是一種常規的獲取高產菌株的方法, 盡管其具有一定的優點,如: 能夠提高突變率, 在較短的時間內獲得更多的優良變異類型。但是, 誘變育種也存在一些問題, 如:有益突變頻率仍然較低, 變異的方向和性質難控制。因此提高誘變效率, 迅速鑒定和篩選突變體以及探索定向誘變的途徑, 是當前研究的重要課題。

復合誘變的效果往往要好于單種誘變劑的誘變效果, 這可能是由于先用物理誘變劑處理以后, 微生物細胞細胞膜的完整性或者滲透性有所改變, 然后再用化學試劑進行處理, 就能更好的與細胞染色體位點進行接觸從而使得誘變效率增加。Ahmed等(2013)先后用伽馬輻射和EMS復合誘變菌株Penicillium chrysogenumNRRL 792, 得到產最高酶活誘變體菌株EMS-1, 試驗結果還顯示突變體菌株所產堿性蛋白酶的穩定性(pH, 熱穩定性)要大大好于野生型。電泳結果顯示野生型與突變型的蛋白酶分子量大小也不同, 誘變結果改變了堿性蛋白酶的分子結構。

目前誘變育種已經與基因工程進行很好的結合,從而獲得更加穩定而高產的突變菌株。Wang等(2010)從嗜冷產堿性蛋白酶海洋微生物菌株Pseudomonassp.中, 利用反向PCR技術克隆該酶的結構基因, 發現1443bp的OFR編碼一組無信號肽的463氨基酸, 序列比對結果顯示該酶屬于絲氨酸類型的金屬蛋白酶,重組蛋白在Escherichia coli成功進行表達。Jasmin等(2010)從海洋真菌Engyodontium album中克隆堿性蛋白酶基因(Eap), 并對其三維結構進行了推測。

堿性蛋白酶主要在洗滌工業上有廣泛的應用。尤其新型的耐氧化、耐高溫、耐堿性、耐高鹽度、耐有機溶劑、及在低溫環境下具有較高酶活的一類堿性蛋白酶更是其中研究的熱點。

Tsuyoshi等(2004)研究了枯草桿菌產堿性蛋白酶的抗氧化性穩定性, 并應用于洗滌劑行業。Kunamneni等(2003)研究了枯草芽孢桿菌PE-11產堿性蛋白酶的熱穩定性, 發現該酶在60°C處理了350min后仍保持100%酶活力。Sudhir等(2010)在一株新穎的嗜高溫菌株Paenibacillus tezpurensissp. nov. AS-S24-II發酵液中發現清潔穩定性良好的堿性蛋白酶。WANG等(2012)在印尼溫泉中篩選到一株產堿性蛋白酶菌株Brevibacillussp. PLI-1, 試驗結果顯示在70°C時該酶具有最高活性。

Raja等(2006)對耐有機溶劑的堿性蛋白酶進行了酶學性質研究, 利用硫酸銨鹽析及層析方法純化酶,酶活力提高了近124倍。Subramani等(2009)篩選到一株海洋放線菌MML1614, 發現其具有很好的耐熱與耐堿性, 與洗滌劑結合后使洗滌效果大幅增加。Hames-Kocabas等(2007)從海泥樣品中篩選得到堿性蛋白酶生產菌株MA1-1, 在pH 9.0、50°C有較高酶活, 同時鑒定出此堿性蛋白酶屬于絲氨酸基團。Jignasha等(2009)在印度沿海篩選到一株嗜堿放線菌Mit-1, 其產堿性蛋白酶不僅耐鹽耐高溫(70°C最適宜溫度), 且耐受有機溶劑, 此類蛋白酶的報道極為罕見。Iram等(2012)在克什米爾地區的冰川土壤中篩選到一株食單胞菌屬(Stenotrophomonassp.)菌株, 該菌株所產堿性蛋白酶在較低溫度(15°C)時具有最高酶活, 而低溫清洗能對一些高檔絲綢織物起到很好的保護作用。

在某些方面, 蛋白酶甚至被用在回收利用廢棄的貝殼類動物中(Anil, 2010), 在處理蓖麻殼的浪費上(Madhuriet al, 2012)也能得到應用。Feng等(2013)在菌株Kocuria kristinaeF7的發酵液中分離到一種很罕見的堿性絲氨酸蛋白酶, 該蛋白酶除了耐鹽耐高溫, 還能改善大豆蛋白質水解產物的口味, 在食品工業中具有較好的應用前景。蛋白酶可以被用作脫毛劑使用, Vijay等(2011)從Bacillus altitudinisGVC11分離到一種新穎的絲氨酸蛋白酶, 試驗發現該酶作用于山羊毛具有很好的脫毛效果, 卻不會損壞羊毛中的膠原蛋白也不影響羊毛的完整性。

影響菌株產酶的因素有很多, 如: 溫度、pH、碳源、氮源、培養溫度、鹽度、溶氧(轉速)等等, 選擇合理的粗酶分離純化過程, 從而很好保持甚至提高其酶活也非常重要。因此, 如何優化培養方案、選擇合適的分離純化工藝, 將是后續研究的重點。

肖昌松, 呂 健, 田新玉, 2001. 嗜堿芽孢桿菌XE22-4-1堿性彈性蛋白酶發酵條件的研究. 微生物學報, 41(5): 611—616

邱雁臨, 梁 亮, 王 亮, 2008. 紫外線與氯化鋰復合誘變選育L-組氨酸產生菌. 現代食品科技學報, 03: 217—219

沈 萍, 范秀容, 李廣武, 1999. 微生物學實驗. 北京: 高等教育出版社, 45—46

周德慶, 2006. 微生物學實驗教程. 北京: 高等教育出版社, 75—76

郝建國, 薛燕芬, 馬延和, 2010. 一株產蛋白酶嗜堿菌株的分離、鑒定及酶學特性. 微生物學報, 50(1): 54—59

梅承芳, 江曉路, 牟海津, 2005. 堿湖高產堿性蛋白酶菌的選育和產酶條件研究. 中國海洋大學學報, 35(4): 613—617

Ahmed F Afifi, Heba I Abo-Elmagd, Manal M Housseiny, 2013.Improvement of alkaline protease production byPenicillium chrysogenumNRRL 792 through physical and chemical mutation, optimization, characterization and genetic variation between mutant and wild-type strains. Ann Microbiol, 35: 147—156

Anil Kumar Singh H S, 2010. Optimization of protease production byStreptomycessp. A6 using statistical approach for reclamation of shellfish waste. World J Microbiol Biotechnol, 26: 1631—1639

Anjali Bose, Vishal Chawdhary, Haresh Keharia, 2014. Production and characterization of a solvent-tolerant protease from a novel marine isolateBacillus tequilensisP15. Ann Microbiol, 64: 343—354

Banerjee U C, Sani R K, Azmi W, 1999. Thermostable alkalineprotease fromBacillus brevisand its characterizationas a laundry detergent additive. Process Biochemistry, 35(1/2): 213—219

Banik R M, Prakash M, 2004. Laundry detergent compatibility of the alkaline protease fromBacillus cereus. Microbiol Res,159: 135—140

Bhaskar N, Sudeepa E S, Rashmi H Net al, 2007. Partial purification and characterization of protease ofBacillus proteolyticusCFR3001 isolated from fish processing waste and its antibacterial activities. Bioresour Technol, 98: 2758—2764

Feng Zhen, Chen Xi, Li Juan-juanet al, 2013. An alkaline protease fromKocuria kristinaeF7: properties and characterization of its hydrolysates from soy protein. Eur Food Res Technol, 236: 293—301

Gupta R, Beg Q K, Lorenz P, 2002. Bacterial alkaline proteases:molecular approaches and industrial applications. Applied Microbiology and Biotechnology, 59(1): 15—32

Hames-Kocabas E Esin, Atac Uzel, 2007. Alkaline protease production by an actinomycete MA1-1 isolated from marine sediments. Annals of Microbiology, 57(1): 71—75

Iram Saba Parvaiz H, Qazi Shabir A, Rather Refaz Aet al, 2012.Purification and characterization of a cold active alkaline protease fromStenotrophomonassp., isolated from Kashmir,India. World J Microbiol Biotechnol, 28: 1071—1079

Jasmin C, Sreeja Chellappan, Rajeev K Sukumaranet al, 2010.Molecular cloning and homology modeling of a subtilisin-like serine protease from the marine fungus,Engyodontium albumBTMFS10. World J Microbiol Biotechnol, 26: 1269—1279

Jellouli K, Bougatef A, Manni Let al, 2009. Molecular and biochemical characterization of an extracellular serineprotease fromVibrio metschnikoviiJ1. J Ind Microbiol Biotechnol, 36: 939—948

Jignasha T Thumar, Satya P Singh, 2009. Organic solvent tolerance of an alkaline protease from salt-tolerant alkaliphilicStreptomyces clavuligerusstrain Mit-1. J Ind Microbiol Biotechnol, 36: 211—218

Johnvesly B, Naik G R, 2001. Studies on production of thermostable alkaline protease from thermophilic and alkaliphilicBacillussp. JB-99 in a chemically defined medium. Process Biochemistry, 37(2): 139—144

Kumar C G, Tiwari M P, Jany K D, 1999. Novel alkaline serineproteases from alkalophilicBacillusspp. purification and some properties. Process Biochemistry, 34(5): 441—449

Kunamneni Adinarayana, Poluri Elllaiah, Davuluri Siva Prasad,2003. Purification and partial characterization of thermostable serine alkaline protease from a newly isolatedBacillus sublitisPE-11. AAPS Pharm Sci Tech, 4(4): 65—72

Madhuri A, Nagaraju B, Harikrishna Net al, 2012. Production of Alkaline Protease byBacillus altitudinisGVC11 using Castor Husk in Solid-State Fermentation. Appl Biochem Biotechnol, 167: 1199—1207

Raja Noor Zaliha Raja Abd Rahman, Lee Poh Geok, Mahiran Basri, 2006. An organic solvent-stable alkaline protease fromPseudomonas aeruginosastrain K: Enzyme purification and characterization. Enzyme and Microbial Technology, 7: 1484—1491

Sreeja Chellappan C, Jasmin Soorej M, Basheer Archana Kishore Ket al, 2011. Characterization of an extracellular alkaline serine protease from marineEngyodontium albumBTMFS10.Microbiol Biotechnol, 38: 743—752

Subramani Ramesh, Mahalingam Rajesh, Narayanasamy Mathivanan, 2009. Characterization of a thermostable alkaline protease produced by marineStreptomyces fungicidicusMML1614. Bioprocess Biosyst Eng, 32: 791—800

Sudhir K Rai, Jetendra K Roy, Ashis K Mukherjee, 2010.Characterisation of a detergent-stable alkaline protease from a novel thermophilic strainPaenibacillus tezpurensissp. nov.AS-S24-II. Appl Microbiol Biotechnol, 85: 1437—1450

Tsuyoshi Nonaka, Masahiro Fujihashi, Akiko Kita Katsuhisa,2004. The crystal structure of an oxdatively-stable subtilisin alkaline serine protease, KP-43, with a C-terminal β-barrel domain. J Biol Chem, 45: 47344—47351

Vijay Kumar E, Srijana M, Kiran Kumar Ket al, 2011. A novel serine alkaline protease fromBacillus altitudinisGVC11 and its application as a dehairing agent. Bioprocess Biosyst Eng,34: 403—409

Wang Fang, Hao Jianhua, Yang Chengyeet al, 2010. Cloning,expression, and identification of a novel extracellular cold-adapted alkaline protease gene of the marine bacterium strain YS-80-122. Appl Biochem Biotechnol, 162: 1497—1505

Wang S L, Yang C H, Liang T Wet al, 2008. Optimization of conditions for protease production byChryseobacterium taeanenseTKU001. Bioresour Technol, 99: 3700—3707

WANG Shuai, LIN Xuezheng, HUANG Xiaohanget al, 2012.Screening and characterization of the alkaline protease isolated from PLI-1, a strain ofBrevibacillussp. collected from Indonesia, hot springs. Oceanic and Coastal Sea Research, 11(2): 213—218