三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)RXR基因克隆及其在蛻皮過程中的表達分析*

王 偉 吳旭干 樓 寶 徐 蕾 劉智俊 成永旭①

(1. 上海海洋大學 水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室 上海 201306; 2. 上海海洋大學 上海高校知識服務平臺水產動物遺傳育種中心 上海 201306; 3. 浙江省海洋水產研究所 舟山 316100)

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是我國一種重要的經濟蟹類, 在海洋捕撈和海水養殖中都占有重要地位(謝忠明等, 2002)。盡管2012年我國三疣梭子蟹的養殖產量已經高達9.96萬t (農業部漁業局,2013), 但是三疣梭子蟹育苗和養殖過程中的蛻皮綜合征(molting death syndrome, MDS)一直是困擾該產業健康發展的重要問題(Takeuchiet al, 1999a, b; Wuet al, 2010a, b; 路允良等, 2012)。MDS是指蟹類不能順利完成蛻皮, 在蛻皮過程中或蛻皮不久便大量死亡的一種綜合癥狀, 這給經濟蟹類養殖生產造成了巨大的經濟損失(Suprayudiet al, 2004), 其形成原因非常復雜, 初步研究結果表明MDS可能與餌料營養及環境因子有密切關系(Danet al, 2011; 路允良等,2012)。深入了解MDS的形成機制, 首先必須研究三疣梭子蟹蛻皮的生理機制, 從而為三疣梭子蟹養殖過程中MDS的控制提供理論參考和實踐依據。

甲殼動物的蛻皮過程受包括蛻皮激素、眼柄神經多肽類和甲基法尼酯等多種激素的聯合調控, 它們有著不同的生理功能和調控路徑(Riddifordet al,2003)。蛻皮激素在蛻皮過程中扮演著十分重要的角色, 其含量在蛻皮過程中呈周期性變動, 蛻皮前含量最高, 蛻皮間期含量最低(Mykles, 2011; Techaet al,2013)。蛻皮激素對甲殼動物蛻皮過程的生理調控是主要通過與蛻皮激素受體(EcR)和類維甲酸X受體(RXR)的二聚體結合來實現的。蛻皮激素與此二聚體的結合體可直接與細胞核上的激素應答原件結合,調節下游基因E74及E75等的轉錄, 從而調控甲殼動物的蛻皮過程(Riddifordet al, 2003; Kimet al, 2005;Techaet al, 2013)。RXR是核受體超家族的一員, 具有核受體家族的典型特征, 在結構上分為A、B、C、D、E、F六區, 組成四個功能結構域(A/B域、C域、D域和E/F域)。目前有關甲殼動物的RXR研究主要集中在RXR的基因克隆及其表達模式分析, 功能研究較少(Wuet al, 2004; Kimet al, 2005; Priyaet al,2009)。先前的研究結果表明, 不同甲殼動物的RXR基因序列及結構存在較大的差異(Duricaet al, 1996;Wuet al, 2004; Kimet al, 2005), 且RXR在不同甲殼動物蛻皮過程中的表達模式也有所不同(Asazumaet al, 2007; 王文青等, 2010; 王瑤等, 2013)。通過研究RXR基因在甲殼動物不同組織及不同蛻皮階段的表達情況, 可以初步了解RXR的表達部位、調控位點及其與蛻皮過程的關系, 從而為深入研究RXR的基因功能奠定基礎。迄今為止有關三疣梭子蟹RXR基因克隆和表達模式的研究報道極少, 僅見NCBI中登錄的一條三疣梭子蟹RXR基因cDNA序列。因此, 本研究在通過三疣梭子蟹轉錄組文庫獲得RXR部分cDNA序列(contig698)的基礎上, 進一步通過反轉錄PCR(RT-PCR)和cDNA 末端快速擴增(RACE)技術,克隆得到了三疣梭子蟹RXR2基因cDNA全長, 并進行相關生物信息學分析, 進一步通過熒光定量PCR(qRT-PCR)技術研究了該基因在三疣梭子蟹不同組織及不同蛻皮階段的表達情況, 結果可以為深入研究三疣梭子蟹RXR的基因功能和闡明蟹類蛻皮的調控機制提供基礎資料, 同時豐富甲殼動物發育生物學的研究內容。

1 材料與方法

1.1 材料與采樣

三疣梭子蟹幼蟹于2011年8月購自浙江舟山宏福水產養殖場, 甲殼寬為7—9cm, 初始體重50—80g,挑選肢體健全、活力較好、處于蛻皮間期的雌體60只, 活體運輸到研究室, 在室內循環水系統中暫養一周, 暫養水族箱體積為150 L(長×寬×高 = 75cm×53cm×47cm), 箱底部放置無毒PVC管(直徑15cm,長15cm)作為隱蔽物, 每箱放8—10只幼蟹, 暫養期間每日下午19:00按照蟹體重的5%—10%投喂章魚,次日上午10:00清理殘餌和糞便。

實驗用蟹暫養一周后, 挑選32只肢體健全、活力較好、處于蛻皮間期(C期)或蛻皮前期(D期)的個體用于實驗。由于三疣梭子蟹極易自相殘殺導致成活率偏低, 因此正式實驗期間每只幼蟹均單獨飼養于小型循環水族箱(水體體積40L, 長×寬×高 = 53cm×18cm×45cm)中。實驗期間自然光照, 水體鹽度為24,水溫24—26°C, pH 7.0—9.0, 溶氧＞5mg/L; 氨氮＜0.5mg/L,亞硝酸鹽＜0.15mg/L。投喂和日常管理與暫養期間基本一致。根據沈潔等(2011)形態學方法將三疣梭子蟹蛻皮周期分為蛻皮期(E期)、蛻皮后期(AB期), 蛻皮間期(C期)和蛻皮前期(D期), 每日檢查每只蟹所處的蛻皮階段, 并記錄。對到達特定蛻皮時期的三疣梭子蟹進行解剖, 采集該蛻皮時期三疣梭子蟹肌肉、肝胰腺、心臟、胃、腸、鰓、Y器官、大顎器、眼柄、胸神經節、三角膜組織用于后續的實驗。每個蛻皮期分別采集5—8只個體, 所有組織樣品液氮速凍后保存于–80°C冰箱用于總RNA的提取。由于D期可以分為D0、D1、D2、D3和D4五個不同的亞期(沈潔等,2011), 考慮到D期每個亞期持續時間較短, 本實驗中D期樣品均來自較為典型的D2亞期。

1.2 RNA提取和cDNA全長的克隆

取凍存的三疣梭子蟹Y器官, 采用總RNA提取試劑盒(TaKaRa, Cat.D9108A)進行總RNA的提取, 分別采用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計法檢測RNA的完整性和純度。使用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit (Clontech, Cat.634923)進行第一鏈cDNA合成。各取1μg總RNA為反轉錄模板, 分別用于5’和3’端RACE擴增。進而采用 Advantage 2 PCR Kit (Clontech, Cat.639207)進行RACE擴增, 所用引物根據三疣梭子蟹轉錄組文庫(NCBI登陸號:SRA051608)篩選到RXR基因核心序列(序列拼接號:contig698)設計而成, 5’-RACE和3’-RACE引物分別命名為PtRXR5-R1、PtRXR5-R2、PtRXR3-F1和PtRXR3-F2, 具體序列見表1。

所得PCR產物瓊脂糖凝膠電泳后采用DNA回收試劑盒(TaKaRa, Cat.9763)進行回收純化, 取1μL回收產物與pMD19-T載體(TaKaRa, Cat.D104A)連接,連接產物轉化至大腸桿菌Top 10感受態細胞(天根,Cat.CB104-01)中, 在37°C、200r/min條件下振蕩培養1—2h, 涂布接種后進行藍白斑篩選, 隨機挑選10個陽性克隆送上海生工生物工程有限公司進行測序。

表1 實驗用PCR引物及序列Tab.1 Primers and their sequences used in the experiment

1.3 序列分析

利用DNAStar軟件中的SeqMan程序對測序結果進行載體序列的去除和目的序列的拼接, 獲得PtRXR全長cDNA; 采用Blast程序分析PtRXR基因與其它動物RXR基因的同源性和一致性; 采用ORF Finder程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)預測其開放閱讀框(ORF)和編碼氨基酸。使用ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)預測PtRXR編碼氨基酸的物理參數, 分別用SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和TMHMM 2.0程序(http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預測其信號肽和跨膜結構。最后采用ClustalX(http://www.clustal.org/)和MEGA 5.0軟件(http://www.Megaso ftware.net/)進行多序列比對和NJ系統進化樹構建。

1.4 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

采用總RNA提取試劑盒(TaKaRa, Cat.D9108A)對各采樣組織進行總RNA的提取, 各取100ng總RNA為反轉錄模板, 采用反轉錄試劑盒(TaKaRa,Cat.D2639A)進行第一鏈cDNA合成。根據三疣梭子蟹RXR cDNA全長序列, 采用Primer Premier 5.0軟件設計定量PCR用特異性引物PtRXR F1/R1及PtRXR F2/R2(表1)。以三疣梭子蟹18S-F/R(表1)為引物對內參基因18S rRNA進行擴增(Yanget al, 2005)。

按照TaKaRa定量PCR試劑盒(TaKaRa, Cat.DRR 420A)說明, 將模板cDNA梯度稀釋后進行標準曲線擴增。當無非特異性擴增出現, 目標基因和內參基因的擴增效率在95%—105%, 標準曲線R2大于0.99時,確定qRT-PCR反應體系與條件, 最終采用PtRXR F1/R1作為RXR定量PCR擴增引物。qRT-PCR的反應體系見表2, 反應條件為: 95°C預變性30s; 95°C變性3s, 60°C退火30s, 共進行40個循環。qRT-PCR反應體系與條件確定后, 以C期三疣梭子蟹肌肉、肝胰腺、心臟、胃、腸、鰓、Y器官、大顎器、眼柄、胸神經節和三角膜11種組織樣品的cDNA作為模板,研究PtRXR在各組織中表達情況。根據PtRXR在各組織中的表達情況, 對Y器官、大顎器、眼柄、胸神經節、肝胰腺、鰓和肌肉中不同蛻皮階段PtRXR基因的表達變化進行研究。每個樣品重復4次, 每個蛻皮階段重復5個體。

表2 PtRXR與18S rRNA基因熒光定量PCR反應體系中各試劑添加量(μL)Tab.2 The volume (μL) of each reagent added to the PCR mixture used for qRT-PCR of PtRXR and 18S rRNA

1.5 數據分析

采用18S rRNA作為內參基因, 計算△Ct, 通過公式△△Ct =△Ct樣品－△Ct對照計算△△Ct, 2–ΔΔCt法計算PtRXR-mRNA的相對表達水平。采用SPSS 17.0軟件對qRT-PCR數據進行統計分析, 所有數據采用平均值±標準差表示, 采用Levene’s法進行方差齊性檢驗, 當不滿足齊性方差時對數據進行反正弦或平方根處理, 采用ANOVA對實驗結果進行方差分析, 采用Tukey’s法進行多重比較, 當P＜0.05時為差異顯著。

2 結果

2.1 PtRXR cDNA全長克隆與序列分析

根據三疣梭子蟹轉錄組文庫(NCBI登陸號: SRA 051608)中RXR的cDNA片段(序列拼接號: contig698),設計多條特異性引物進行RACE擴增, 直到3’和5’端分別出現poly A和起始密碼子及非編碼區, 將所得序列進行拼接和驗證, 確定本研究中三疣梭子蟹RXR基因cDNA序列全長為1718bp, 命名為PtRXR2,GenBank登錄序列號為KF914662。序列分析結果表明, 該基因包括5’非編碼區(5’-UTR)141bp、3’-UTR 209bp和開放閱讀框(ORF)1368bp, 編碼455個氨基酸。ORF編碼氨基酸的預測分子式為C2176H3479N605O671S28,分子量為49.75kDa, 理論等點6.79。進一步分析表明該蛋白不存在信號肽序列和跨膜結構區, 因此推測該蛋白不屬于分泌蛋白。整體上, PtRXR2和NCBI上已經登錄的PtRXR(AGV08303)存在較大差異, 兩者不僅5’-UTR的長度不同, 且PtRXR在ORF中存在168bp和60bp的核苷酸缺失, 其它多處存在共15個核苷酸的序列差異。

PtRXR2的氨基酸序列從N端到C端具有4個典型功能結構域: A/B域(轉錄激活域)、C域(DNA結合域, DBD)、D域(鉸鏈域)、E/F域(含有配體結合域,LBD)。C域具有P-box和D-box, D域中存在T-box (圖1)。不同甲殼動物RXR的氨基酸比對結果表明, 三疣梭子蟹PtRXR2、招潮蟹(Uca pugilator)UpRXR、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)LvRXR和美洲鰲蝦(Homarus americanus)HaRXR1 在氨基端(25個氨基酸)序列相對保守, 而這些氨基酸序列在PtRXR、HaRXR2、黑背陸地蟹(Gecarcinus lateralis)GlRXRa、褐蝦(Crangon crangon) CcRXR1和中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)EsRXRb的A/B域中缺失(圖2中實線方框標出); 5種蝦蟹類RXR的C域高度保守, 均含有保守的P-box與D-box, DBD中含有兩個C2C2型鋅指結構和兩個α螺旋; D域具有保守的T-box, 但PtRXR2、PtRXR、UpRXR、LvRXR和HaRXR1等的T-box中存在六個氨基酸殘基缺失(圖2中實線方框標出); E/F域的E區較為保守, 5種蝦蟹類在該區均含有氨基酸序列完全一致的轉錄激活結構域(AF-2); F區較短且保守性最低, 但PtRXR和PtRXR2的F區推斷氨基酸序列完全一致(圖2)。

圖1 PtRXR2基因cDNA全長及預測的氨基酸序列Fig.1 Full cDNA sequence and its deduced amino acid sequence of PtRXR2

整體上, PtRXR2和PtRXR一致性最高, 兩者差異主要在于PtRXR的A/B域中存在兩段氨基酸序列的缺失(圖2中上劃線標示), 對應于PtRXR ORF中缺失的核苷酸序列; PtRXR2與藍蟹(Callinectes sapidus)兩種RXR亞型的一致性最高, 分別為99%和98%; 與濱蟹(Carcinus maenas)RXRⅠ序列的一致性為97%;與黑背地蟹三種RXR亞型的一致性分別為87%、86%和86%; PtRXR2與蝦類RXR的氨基酸序列比對結果顯示, PtRXR2與褐蝦RXR 三種亞型的氨基酸序列一致性較高, 在84%—85%之間; 與凡納濱對蝦、中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)和日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)RXR氨基酸序列一致性相對較低, 分別為76%、75%和74%。

圖2 三疣梭子蟹與其它甲殼動物的RXR氨基酸序列比對Fig.2 Comparison of amino acid sequences of RXR between P. trituberculatus and other crustacean species

基于20種節肢動物(甲殼動物和昆蟲)的RXR/USP氨基酸序列, 采用MEGA(version 5.0)軟件鄰接法(Neighbor-Joining)構建系統進化樹, 結果顯示昆蟲綱中國蜜蜂(Apis cerana)、沙蟋(Gryllus firmus)和太平洋折翅蠊(Diploptera punctata)聚為一支, 它們與甲殼動物親緣關系更近, 與甲殼動物RXR聚為一大支,其余聚為另外一支。甲殼動物中蝦蟹類的RXR, 在進化上更為接近, 飛馬哲水蚤(Calanus finmarchicus)在甲殼綱為獨立一支。三疣梭子蟹、普通濱蟹與濱蟹的RXR親緣關系最近, 它們聚為一支(圖3)。

圖3 RXR氨基酸序列的NJ進化樹Fig.3 The neighbor-joining phylogenetic tree for RXRs

2.2 PtRXR2在蛻皮間期不同組織中的表達情況

定量PCR結果表明, PtRXR2在三疣梭子蟹C期的肌肉、肝胰腺、心臟、胃、腸、鰓、Y器官、大顎器、眼柄、胸神經節和三角膜中均有表達, 且各組織中的PtRXR2-mRNA表達水平差異顯著(P＜0.05, 圖4)。Y器官中的PtRXR2-mRNA表達水平最高, 其余依次為鰓＞大顎器＞眼柄＞三角膜＞胃＞胸神經節＞心臟＞腸＞肌肉＞肝胰腺, 其中肝胰腺中的PtRXR2-mRNA表達水平僅為Y器官的10.92%。

2.3 PtRXR2在不同蛻皮階段的表達情況

根據PtRXR2在不同組織中的表達情況, 采用Y器官、眼柄、胸神經節、大顎器、肌肉、肝胰腺和鰓7個主要組織, 研究PtRXR2-mRNA在三疣梭子蟹蛻皮周期中的表達變化情況。結果表明, PtRXR2-mRNA在7種組織中的表達水平均在不同蛻皮階段變化顯著(P＜0.05), 但不同組織呈現不同的變化模式(圖5)。Y器官中PtRXR2-mRNA的表達水平在E期最低, 蛻皮后AB期顯著升高, 其相對表達量是C期的5倍以上, C期和D期的表達水平顯著下降, 但仍顯著高于E期; 在整個蛻皮周期中, 眼柄、胸神經節和肝胰腺中PtRXR2-mRNA表達變化模式基本一致, 為E期表達量較低, AB期顯著升高, C期顯著降低, D期顯著升高; 與上述三個組織的PtRXR2-mRNA變化趨勢相反,大顎器中PtRXR2-mRNA在AB期的表達水平最低,其余三個階段相對表達量無顯著差異; 鰓中PtRXR2-mRNA在C期表達量最高, D期最低, E期和AB期表達量處于兩者之間, 且各期間的相對表達量差異顯著(P＜0.05); 在整個蛻皮周期中, 肌肉中PtRXR2-mRNA表達水平相對較低, 各期相對表達量依次為AB期＞C期＞E期＞D期(圖5)。

圖4 蛻皮間期三疣梭子蟹各組織中PtRXR2-mRNA的表達差異分析Fig.4 Analysis of expression difference of PtRXR2-mRNA in various tissues of P. trituberculatus at intermolt stage

圖5 不同蛻皮階段三疣梭子蟹七種組織中的PtRXR2-mRNA表達差異分析Fig.5 Analysis of expression difference of PtRXR2-mRNA in seven tissues of P. trituberculatus at different molting stages

3 討論

3.1 PtRXR2序列結構分析

本研究通過轉錄組測序和RACE技術, 獲得PtRXR2基因的cDNA全長序列, 該基因與NCBI已登錄的PtRXR基因在5’-非編碼區和ORF中存在多處核苷酸和預測氨基酸序列差異, 且PtRXR在A/B域存在兩段氨基酸序列的缺失, 長度分別為56和20個氨基酸(圖2中上劃線標示), 對應于PtRXR ORF序列中缺失的長度分別為168bp、60bp的兩段核苷酸序列。因此, 初步推斷PtRXR2和PtRXR為三疣梭子蟹RXR的兩個不同基因, 而非選擇性剪切造成的不同轉錄本或亞型, 將此基因暫命名為PtRXR2。整體上,不同甲殼動物的RXR較為保守, 已知蝦蟹類的RXR與PtRXR2氨基酸序列一致性高達70%以上, 特別是C、D功能結構域和E區保守性較高。常見甲殼動物RXR的C域均含有高度保守的P-box和D-box典型結構, 其中P-box與RXR作用元件的DNA結合有關,D-box與同型二聚體的形成有關, 從而保證RXR作用元件及二聚體的形成和調控作用的發揮(Devarakondaet al, 2003; Asazumaet al, 2007); D域也存在DNA識別的T-box(Kimet al, 2005; Priyaet al, 2009), 但是部分種類的RXR或不同轉錄本存在6個氨基酸缺失,有趣的是在T-box中存在這6個氨基酸的物種在A/B域N端都存在25個氨基酸殘基缺失, 造成這種差異的原因可能與進化或RNA的選擇性剪切有關(王文青等, 2010); E/F域含有保守的配體結合域(LBD), 所有物種均具有一個保守的轉錄激活結構域(AF-2, 見圖2)(Wanget al, 2000)。然而, 不同蝦蟹類RXR的A/B域和E/F域的F區通常存在一定的差異。A/B域為轉錄激活域, 不同物種的RXR在該序列上差異較大,同一物種的不同RXR亞型也有所不同(Huet al, 2003;Kimet al, 2005; Techaet al, 2013), 這暗示不同RXR基因及同一RXR基因的不同亞型生理作用可能有所不同, 這種功能差別可能是通過不同信號通路的轉錄調控實現的(王文青等, 2010; Dawsonet al, 2012)。盡管RXR的F區較短, 但不同物種間F區的差別較大, 其氨基酸序列存在較大變化或缺失, 同一物種的不同RXR基因F區氨基酸序列及長度基本一致(圖2),但是同一RXR基因亞型可能會通過選擇性剪切形成不同的轉錄本, 造成F區氨基酸長度不同甚至缺失(Kimet al, 2005; Techaet al, 2013)。迄今為止, 有關RXR的F區生物學功能研究極少, 推測認為該區域可以調節配體與LBD的結合力、二聚體的形成及參與調節其它調控因子間的交互作用(Wuet al, 2004),如在哺乳動物中, F區的部分氨基酸序列與轉錄調控有關(Dawsonet al, 2012)。

3.2 PtRXR2的生理功能及其與蛻皮的關系

絕大部分動物體內都存在RXR/USP(昆蟲中的超氣門蛋白, 類似于甲殼動物的RXR)基因, 該基因家族在細胞動物生長發育、形態發生、細胞增殖分化、新陳代謝和細胞內環境平衡穩定等過程中起著非常重要的調控作用(Mangelsdorfet al, 1990; Kimet al,2005; Dawsonet al, 2012)。有關大鼠的研究結果表明,鼠類存在三種不同的RXR基因, 分別命名為RXRα、RXRβ和RXRγ, 這三種RXR蛋白的DBD和LBD極為保守, 但其A/B域的氨基酸序列差異較大, 推測它們可能參與了不同的轉錄調控過程, 起著不同的生理作用(Mangelsdorfet al, 1992)。進一步的研究表明,RXRα在肝臟等代謝器官中表達水平較高, 主要參與脂類和維生素A的代謝調控, 這是因為RXRα的DNA反應元件是細胞視黃醇結合蛋白(CRBPII)和載脂蛋白(apoAI)基因啟動子的一部分, 而CRBPII和apoAI主要參與維生素A和脂類的運輸和代謝; RXR β與老鼠的神經鞘質損傷和睪丸生理功能有關, 但該基因的表達部位較多(Huanget al, 2011); RXRγ主要在神經系統、肌肉和上皮組織中表達, 主要調控細胞的增殖分化和神經信號傳導等(K?niget al, 2012)。

迄今為止, 有關甲殼動物的RXR基因功能研究較少。現有研究表明, 甲殼動物的RXR基因與蛻皮調控有關, 如中國明對蝦和中華絨螯蟹Y器官中的RXR-mRNA在蛻皮后表達水平逐步升高, 在蛻皮前達到最大值(Priyaet al, 2009; 王瑤等, 2013)。而甲殼動物和昆蟲體內的RXR/USP具體如何參與蛻皮調控則非常復雜, 如: 對中國明對蝦中RXR的RNAi實驗表明, RXR正向調控中國明對蝦幾丁質酶的基因表達(Priyaet al, 2009)。甲殼動物蛻皮前通常需要高含量的幾丁質酶水解舊殼中的甲殼素以便舊殼裂開, 從而有利于蛻皮的進行(沈潔等, 2011); 昆蟲體內20-羥基蛻皮酮(20-E)-EcR-USP復合體可以調控Br-C、E74、E75和E93等20-E初級應答基因的表達, 這些基因觸發次級應答基因表達后最終會引起昆蟲變態和蛻皮過程中的細胞自噬和凋亡(Liuet al, 2009; 李康等,2011)。值得注意的是, 同一甲殼動物的一種RXR基因可以通過選擇性剪切得到不同的轉錄本及蛋白,從而發揮不同的調控作用(Kimet al, 2005; Techaet al,2013)。

本研究結果表明, PtRXR2在三疣梭子蟹蛻皮間期的11個組織中都有表達, 且在內分泌器官(Y器官和大顎器)、神經系統(眼柄和胸神經)、上皮組織發達的三角膜、腸道和胃, 以及肌肉組織中表達水平相對較高, 在肝胰腺中的表達水平最低(圖4), 這與哺乳動物的RXRγ在不同組織中的表達特性基本一致(Mangelsdorfet al, 1992; Huanget al, 2011)。此外, 根據PtRXR2與哺乳動物的RXR氨基酸序列比對結果發現, PtRXR2也是與RXRγ一致性最高。因此, 作者推測PtRXR2可能類似于哺乳動物RXRγ型。先前研究表明, 甲殼動物的RXR均在Y器官中表達水平較高, 這是因為Y器官主要分泌蛻皮酮調節蛻皮過程。就不同甲殼動物種類而言, RXR在其它器官中的表達水平不盡一致。RXR在中華絨螯蟹、日本囊對蝦和中國明對蝦的肝胰腺中表達水平僅次于Y器官(Asazumaet al, 2007; Priyaet al, 2009; 王瑤等, 2013),但本研究PtRXR2在肝胰腺中的表達水平最低。造成這種差異的原因可能是由于不同蝦蟹中發現的RXR基因種類或轉錄本有所不同, 它們具有不同的生理功能, 因而在不同組織中的表達模式存在差異。如RXRα主要調節哺乳動物的脂類和維生素A代謝,因此在肝胰腺等代謝器官中表達水平較高, 而RXRγ則調控細胞的增殖分化和神經信號傳導等, 故在神經系統、肌肉和上皮組織中表達較高(Mangelsdorfet al, 1992; K?niget al, 2012)。本研究結果表明, PtRXR2在三疣梭子蟹的Y器官、眼柄和胸神經節中均是AB期表達水平最高, 但是蛻皮過程中的E期最低, 這可能是因為上述內分泌器官和神經組織的細胞增殖主要發生在AB期(Changet al, 2011), 而PtRXR2可能在此階段參與這些細胞增殖過程; 肌肉中的PtRXR2表達水平在AB期和C期較高, E期和D期最低, 與肌肉的生長和營養物質積累主要發生這兩個階段相對應(沈潔等, 2011); 肝胰腺中的PtRXR2在AB期最高, 暗示肝胰腺中的上皮細胞增殖和分化主要發生在此階段, 肝胰腺中C期表達水平最低, 也暗示PtRXR2主要作用不是參與肝胰腺中的脂類營養代謝過程; 而蛻皮周期中, PtRXR2-mRNA在鰓和大顎器中的變化原因不詳。盡管本研究克隆了PtRXR2的cDNA全長, 根據其生物學信息學分析及其在蛻皮過程中表達分析結果, 推測該基因可能類似于哺乳動物的RXRγ型, 但由于缺乏相關的功能驗證, 故PtRXR2在三疣梭子蟹蛻皮過程中的準確生理功能、調控機制及其基因分類有待進一步深入研究。

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