小分子有機碳、氮源對海洋著色菌(Marichromatium gracile)生長和去除高濃度無機三態氮的影響*

蔣 鵬 趙春貴 楊素萍

(華僑大學生物工程與技術系 廈門 361021)

集約化、高密度水產養殖的迅速發展, 水體殘餌、藥物、代謝和排泄物及其它有機物的滯留和沉積,以及養殖水體富營養化和有害污染物(如: 銨氮亞硝氮硫化氫H2S和藥物殘留等)的積累等(Díazet al, 2012; Coreyet al, 2013), 導致水生態環境破壞, 嚴重制約了水產養殖的發展(Burfordet al, 2001; Yusoffet al, 2011)。因此, 盡快去除養殖水體中等有毒有害物質, 恢復水體微生態平衡, 是解決水產養殖健康發展的關鍵問題(Zhouet al, 2009)。微生物修復技術已廣泛應用于水產養殖業, 在養殖水體的凈化和養殖疾病的控制等方面發揮著重要作用, 但微生物在利用和轉化有機物的過程中, 能夠產生小分子有機物(如: 糖類、有機酸、醇、肽類、氨基酸等), 從而引起水體溶解氧和pH值變化, 對水體微生物種群的生長代謝產生明顯影響。因此, 復雜多樣的養殖水體環境勢必影響微生物制劑功效, 研究小分子有機物對微生物制劑功效的影響, 對微生物制劑的合理使用具有重要的指導意義。

不產氧光合細菌(APB)已被廣泛應用于水產養殖業(Qiet al, 2009), 其代謝方式靈活多樣, 能夠利用異養微生物代謝產生的有機物(糖、酸和醇)、H2S及氨等合成細胞自身物質。APB不僅可作為餌料, 也可抑制水體病原菌生長, 增強養殖動物的抗病能力, 甚至能有效去除水體中等有害物質。目前, 關于APB對去除特性及其環境因素的研究已有較多報道, 如: 光、氧、鹽度和pH對Rhodopseudomonas palustris2-8菌株去除能力的影響(陳燕紅等, 2010); 在為氮源的體系中, 不同碳源對Rhodobacter sphaeroidesP4菌株去除的能力的影響(俞吉安等, 2000),以及對4種紫色非硫細菌分別去除能力影響(邱宏端等, 1999)。一般來說, 在適宜菌體生長的光、氧、溫度、pH、鹽度和碳源等條件下, 菌體對均具有良好的去除能力, 但不同菌株對無機三態氮(和硝氮的去除能力有很大差異, 再者研究所用體系起始濃度較低, 較難反映出現有實驗菌株的最大去除潛力。特別是在無機三態氮共存的海水體系中, 小分子有機物對APB菌株去除高濃度無機三態氮影響的研究鮮有報道, 尤其是對有機氮化物影響的報道更為少見。

現有研究表明, 有機氮存在時,Bacillus megateriumX2和Bacillussp. LY等芽孢桿菌去除水體的能力明顯降低, 甚至使水體濃度升高(侯穎等,2006; 何霞等, 2007)。研究顯示, APB也具有氨化作用, 能夠將有機氮化物轉化為氨, 但在有機氮源存在時, APB對水體無機三態氮去除能力究竟如何目前還不是很清楚。本文從福建泉州洛陽橋紅樹林環境中分離獲得一株海洋著色菌(Marichromatium gracile)YL28菌株(趙江艷等, 2011), 前期研究表明, 該菌株不僅能很好地去除水體中的高濃度硫化物, 而且能以為唯一氮源生長, 并對有很高的耐受能力和去除能力(蔣鵬等, 2013), 本文在適宜(光照、厭氧、溫度、鹽度和pH)的條件下, 在高濃度無機三態氮共存的模擬海水水體中, 著重研究了小分子有機碳源(葡萄糖、乙酸鈉和乙醇)、有機氮(蛋白胨和尿素)和水體pH對該菌株生長和去除無機三態氮過程的影響, 并從海水養殖場排水口取樣, 在實驗室進一步觀察了該菌株對養殖水體無機三態氮的去除能力。本研究考察了該菌株同時脫除水體無機三態氮的潛力,也為APB制劑的環境適應性和合理應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種: 海洋著色菌(Marichromatium gracile)YL28菌株, 其16S rRNA基因GenBank登錄號為JF719917, 本實驗室分離鑒定保藏(趙江艷等, 2011)。

1.2 方法

1.2.1 培養基和菌種懸液的制備 菌種培養基:采用改良的Pfennig(1988)紫色硫細菌無機選擇性培養基(Trüperet al, 1992), 以2.0g/L無水乙酸鈉為碳源,以0.12g/L Na2S2O3取代0.36g/L Na2S·9H2O, 鹽度(NaCl)為3, pH值為7.0。無碳源和氮源的培養基配制:刪去菌種培養基中的碳源和氮源, 根據實驗要求添加碳源和無機三態氮即為模擬海水水體。菌種懸液的制備: 將菌種接種于菌種培養基中, 接種量為5%(v/v), 接種后用無菌的菌種培養基充滿培養瓶, 于最適條件((28±1)°C、3000lx光照厭氧)(趙江艷等, 2011)培養5d, 8000r/min離心10min收集菌體, 用無菌超純水洗滌3次, 懸浮菌體制備菌種懸液。

1.2.2 測定體系和培養條件 取菌種懸液, 按5%(v/v)接種量, 分別接種到以乙酸鈉(2.00g/L)、葡萄糖(4.69g/L)和乙醇(1.12mL/L)為唯一碳源(相當于體系中乙酸鈉的含碳量), 無機三態氮共存的模擬海水水體中, 測定不同有機碳源對菌體生長和無機三態氮去除的影響。以乙酸鈉(2.00g/L)為唯一碳源, 按5%(v/v)接種量, 分別接種到添加有①蛋白胨、②蛋白胨和無機三態氮、③尿素、④尿素和無機三態氮4種不同氮源的模擬海水水體中, 其中尿素和蛋白胨中的含量分別為0.24g/L和0.14g/L(氮含量近似), 用于測定有機氮源對菌體生長和無機三態氮去除的影響。在以乙酸鈉(2.00g/L)為碳源、無機三態氮共存的模擬海水體系中, 設定其pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0和9.0, 按5%(v/v)接種量接種后用于測定pH對菌體生長和無機三態氮去除的影響。每個處理設置三個重復, (28±1)°C、3000lux光照厭氧培養, 充氮氣取樣,測定三氮含量、菌體生物量和水體pH。

1.2.3 菌株YL28對實際海水養殖廢水中無機三態氮的去除效率 從福建廈門集美區集美大學水產學院水產養殖試驗場取水樣, 室溫靜置12h, 取樣測定初始無機三態氮含量, 并分裝到培養瓶中。接種后取水樣補滿培養瓶, 起始菌體生物量(OD660)為0.07, 總容積為560mL。每個處理設置3個重復, (28±1)°C、3000lux光照厭氧培養, 培養過程中取樣測定三態氮含量, 設置未接種水樣為對照組。

1.2.4 生物量和pH測定 采用比濁法測定菌體生物量, 在光程為1cm比色杯中, 于UV-3200PCS紫外可見分光光度計(MAPADA)上, 測定660nm下的光密度(OD660), 即用OD660表示菌體生物量。用pH計(DELTA 320型, Mettler-Toled)測定樣品的pH值。

1.2.5 無機三態氮的測定和計算 無機三態氮的含量均以氮素的含量計算, 重復測定3次。測定采用Nessler's試劑分光光度法;測定采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法;測定采用紫外分光光度法(APHA, 1998)。按公式r=Ct?C0和R=(Ct?C0)/C0×100%分別計算無機氮的去除量(r)和去除率(R), 式中C0和Ct分別表示無機三態氮的初始濃度和測定時的濃度。

2 結果與分析

2.1 碳源對菌株生長和高濃度無機三態氮去除的影響

在不同碳源中, YL28菌株對模擬水體中無機三態氮的去除能力如圖1所示。結果表明: 隨著處理時間延長, 模擬水體中的的去除率增大, 菌體生物量和pH值升高, 并逐漸趨于穩定。在處理過程中, 模擬水體中的含量均出現暫時升高的現象, 與乙醇相比, 葡萄糖和乙酸鈉為碳源時無機三態氮的去除速率較高。菌體生長速率和生物量與水體pH值變化呈正相關, 生物量高, 則水體pH值高, 菌體生物量和生長速率由高到低排列的碳源順序為乙酸鈉、葡萄糖和乙醇。以葡萄糖、乙酸鈉和乙醇為碳源時, 處理6.5d, 菌體對260.05mg/L的去除率分別為93.40%、84.55%和66.63%,80.50mg/L和100.06mg/L均能被完全去除。3種碳源中, 乙酸鈉中的菌體生長最佳, 其菌體生物量(OD660)達1.9; 葡萄糖為碳源時,的去除能力最高。由此可見, 在含有高濃度無機三態氮的模擬水體中, YL28菌株能夠良好地生長。在葡萄糖、乙酸鈉或乙醇為唯一碳源的模擬水體中, 該菌株均能有效地去除高濃度的無機三態氮; 碳源不同, 菌體生長和去除無機三態氮的能力有差異, 且在無機三態氮去除過程中能夠產生暫時積累, 隨著處理時間的延長, YL28菌株均能有效地去除模擬水體中的

圖1 碳源對無機三態氮共存水體中 (c)的去除率、菌體生物量(OD600, d)和pH值(e)的影響Fig.1 Effects of carbon source on removal of ammonium (a), nitrite (b), nitrate (c), bacterial growth (OD600, d) and pH (e) in seawater simulated in high concentration of inorganic nitrogen

2.2 有機氮對菌株生長和高濃度無機三態氮去除的影響

在含蛋白胨或尿素的模擬水體中添加無機三態氮, 對模擬水體中菌體生長、水體pH值和無機三態氮去除的影響如圖2和圖3所示。在蛋白胨、蛋白胨和無機三態氮、尿素、尿素和無機三態氮4組氮源的模擬水體中, 隨YL28處理時間延長, 菌體生物量和水體pH值逐漸增加, 但培養結束時, 菌體生物量(OD660)在0.27—0.37間, 水體pH值在8.4—9.2間, 與乙酸鈉為唯一碳源的無機三態氮模擬水體生長相比(圖4d), 在含蛋白胨或尿素的模擬水體中, 菌體的生物量明顯降低。

YL28菌株在處理以蛋白胨或尿素為唯一氮源的模擬水體過程中, 能夠通過氨化作用降解蛋白胨或尿素產生的大量和少量而未能檢測到的產生(圖3a, c)。處理1d時, 水體中含量最高, 隨著時間進一步延長,的含量逐漸降低, 蛋白胨降解產生的最終幾乎被完全去除, 而尿素降解的不能被完全去除,52.70%殘留在水體中。蛋白胨或尿素的模擬水體中,添加無機三態氮, 隨著時間的延長, 水體中逐漸降低, 處理6.5d, 降低80%以上; 處理1d時,有所升高, 然后逐漸降低,很快被完全去除, 而則不能被完全去除。因此, 環境水體中含有高濃度蛋白胨或尿素等有機氮化物時, 由于菌體具有氨化作用, 使水體中含量升高, 表觀上呈現菌體去除的能力降低,甚至水體中含量升高, 但該菌株仍表現出良好的的去除能力。

圖2 有機氮對菌體生物量(OD600, a)和水體pH值(b)的影響Fig.2 Effects of organic nitrogen sources on bacterial growth (OD600, a) and pH (b) in simulated seawater

圖3 不同氮源對模擬水體中的去除影響Fig.3 Effects of nitrogen sources on removal of ammonium (□), nitrite (▲), nitrate (○) in simulated seawater

圖4 pH對無機三態氮共存水體中的去除率、菌體生物量(OD600, d)和pH(e)的影響Fig.4 Effects of pH on removal of ammonium (a), nitrite (b), nitrate (c), bacterial growth (OD600, d) and pH (e)

2.3 pH對菌體生長和高濃度無機三態氮去除的影響

在不同pH的模擬水體中, YL28菌株對模擬水體中的無機三態氮的去除及其菌體生長如圖4所示, 模擬水體中的菌體生物量和水體pH值升高, 無機三態氮去除率升高, 并逐漸趨于平衡, 水體處理過程中呈現出含量暫時升高的現象。起始pH值為7.0時, 菌體的生長速率和最終生物量最高, 最大生物量(OD660)約為2.1。起始pH值為6.0—9.0時, 菌體對水體中均具有良好的去除能力, 其中能被完全去除; 而pH對的去除影響較大, pH=6.0時,的去除率最高, 去除率可達100%; pH=8.0時去除率可達60%。起始pH=5.0時, 雖然菌體生長很差, 但對具有一定的去除能力, 對則去除能力很差, 去除率僅為7%。

2.4 對實際海水養殖廢水無機三態氮去除

以不添加菌的樣品為對照, YL28菌株異位處理實際海水養殖水體過程中的含量變化如圖5所示。結果表明: YL28菌株對實際海水養殖水體樣品中的均具有良好的去除效果。處理結束時, 與對照組相比,含量明顯降低,被完全去除, 而對照組則均有殘留,殘留更高。在處理過程中, 雖然水體暫時性地積累但又被很快除去。最大積累量為0.28mg/L, 遠遠大于水體中的去除量, 表明該菌株具有硝化作用,能夠將轉化為究竟是否如此, 尚需要進一步證明。

圖5 YL28對海水養殖水體中 (c)的去除率的變化Fig.5 Changes in the removal of ammonium (a), nitrite (b), and nitrate (c) in mariculture water by stain YL28

3 討論

APB能夠利用異養微生物代謝產生的有機物(糖、酸和醇)、H2S及氨等合成細胞自身物質, 有效去除水體中等有害物質, 已被廣泛應用于養殖水體有害污染物的凈化(王芳等,2010; 鄭卉等, 2012)。模擬水體實驗研究表明, 不同菌株對無機三態氮的去除能力表現出很大差異; 利用不同的碳源, 菌株對無機三態氮的去除能力也表現出很大差異, 如: 醋酸鹽對莢膜紅桿菌(Rhodobacter capsulatus)去除的能力有促進效果(邱宏端等, 1999), 葡萄糖能降低Rhodobactersp.S(劉雙江等, 1995)和Rhodobacter sphaeroidesP4(俞吉安等, 2000)對的去除能力。而本研究的特色是在無機三態氮共存的模擬體系中探討了YL28菌株對無機三態氮的去除能力及其受小分子有機氮源和碳源的影響。研究結果表明, YL28菌株能良好地去除無機三態氮, 尤其是對有很高的耐受能力和去除能力, 與文獻報道的APB菌株相比, 該菌株是耐受和去除能力最高的菌株之一(蔣鵬等,2013)。在適宜條件下, 可完全去除水體中高達80.50mg/L表明該菌株具有去除實際水體三態無機氮的能力, 尤其是去除的應用潛力。由于該菌株對無機三態氮的去除能力較高, 在實際應用時可減少制劑的用量, 從而降低使用成本。在小分子有機碳源存在時, 該菌株均能有效地去除水體高濃度無機三態氮, 尤其具有高效去除和的能力; 而在有機氮化物(尿素和蛋白胨)存在時, 該菌株對高濃度無機三態氮體系中的去除能力影響明顯, 但對的去除能力影響不大。通常情況下, 養殖水體中中不但三態無機氮共存, 也存在糖類、酸類、醇類、肽類和氨基酸等多種多樣的有機化合物。因此, 揭示水體有機化合物對APB去除無機三態氮的規律, 對于開發高效的微生物制劑以及制劑的合理應用都具有重要的指導意義。

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