櫛孔扇貝BI-1基因的克隆與表達分析*

苗國英 亓海剛 李 莉 闕華勇① 張國范 胡曉麗

(1. 中國科學院海洋研究所 青島 266071; 2. 中國科學院大學 北京 100049; 3. 中國海洋大學 青島 266003)

櫛孔扇貝(Chlamys farreri)是我國重要的養(yǎng)殖貝類, 自然分布于我國北方黃渤沿海以及朝鮮和日本沿海(王如才等, 1993)。貝類的大規(guī)模人工繁育以及養(yǎng)殖生產實踐表明, 優(yōu)良種質是決定貝類產業(yè)能否健康可持續(xù)發(fā)展的首要因素, 選育抗逆性強、生長性狀優(yōu)良的品系, 是貝類育種的重要目標(張國范,2006)。開展櫛孔扇貝功能基因研究, 有助于從分子水平上研究重要生命現(xiàn)象的基本規(guī)律, 推動櫛孔扇貝基礎研究并為良種選育提供參考。

凋亡(apoptosis)是細胞在特定應激條件下或者特定發(fā)育階段下發(fā)生的可調控的死亡現(xiàn)象, 又稱細胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)。凋亡本質上是一種具有自我保護和調節(jié)性質的細胞死亡事件,涉及一系列相關基因的激活、表達及調控等作用, 是由基因控制的基本生物學過程之一(張曉暉等, 2002)。

Bax Inhibitor-1 (BI-1)基因是一種細胞凋亡調控因子, 存在于所有脊椎動物中, 該基因主要定位于大鼠的7號染色體、小鼠的15號染色體、豬的5號染色體和人的12q12-q13 (Walteret al, 1994, 1995; Kimet al, 2003)。該基因首先是在1994年由Walter等人在小鼠的睪丸基因庫中發(fā)現(xiàn)的, 并命名為TEGT(testis enhanced gene transcript) (Walteret al, 1995),其后Xu等(1998)在酵母中克隆出了能抑制Bax作用的基因, 命名為Bax Inhibitor-1, 即BI-1。BI-1蛋白是一個大小為25—27kDa的跨膜蛋白, 一般含有6—7個跨膜結構域(Bolducet al, 2003; Kawai-Yamadaet al, 2004), 主要定位在細胞的內質網(wǎng)膜、核外膜, 包含多個蘇氨酸磷酸化位點, 但缺乏O-糖基化位點及N-糖基化位點(Xuet al, 1998; Kawai-Yamadaet al,2001; Bolducet al, 2003)。BI-l基因主要通過參與線粒體和內質網(wǎng)途徑發(fā)揮對細胞凋亡的調節(jié)功能(Kawaiet al, 1999; Tsujimotoet al, 2003; Chaeet al,2004)。

BI-1基因作為一種重要的凋亡調控因子, 在一些物種中已有了深入的研究(Hückelhovenet al, 2001;Bolducet al, 2002; Coupoet al, 2004; Watanabeet al,2009), 但是在貝類中的分子類型和作用還沒有被揭示。因此, 本研究通過RACE技術克隆了櫛孔扇貝(Chlamys farreri)中的BI-1基因全長cDNA序列, 并進一步采用熒光定量PCR技術揭示了該基因在櫛孔扇貝不同組織中的表達情況和在不同應激條件下的表達變化特點。本研究旨在為開展櫛孔扇貝BI-1基因的功能以及櫛孔扇貝凋亡相關基礎研究提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗所用櫛孔扇貝(殼長50mm±5mm)均來自青島膠南山東頭村扇貝養(yǎng)殖場, 扇貝取回后清除表面污物和附著生物, 于18°C海水中充氣暫養(yǎng), 每日更換過濾海水, 并投喂三角褐指藻、金藻和螺旋藻粉混合餌料, 一周后用于實驗。

1.2 總RNA提取和cDNA的合成

取健康的櫛孔扇貝, 抽取其血液, 按照Trizol法提取總RNA?？俁NA的完整度用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。取1μg總RNA, 參照立陶宛Fermentas公司的RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit使用說明, 反轉錄合成cDNA模板, 置于-20°C的冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 CfBI-1基因cDNA片段的克隆

在GenBank上找到人、非洲爪蟾、果蠅等物種的BI-1蛋白序列, 并將這些序列用tBLASTn程序與櫛孔扇貝轉錄組測序序列進行比對, 得到了與這些物種BI-1相近的基因片段, 根據(jù)期望值、相似度、得分等參數(shù)將基因片段篩選, 從而獲得CfBI-1基因的候選序列片段。根據(jù)獲得的基因片段設計擴增引物F1和R1 (表1)。以櫛孔扇貝的cDNA為模板, F1和R1為引物, 進行CfBI-1基因片段的擴增與測序驗證。PCR反應體系為25μL, 反應條件如下: 94°C預變性3min; 94°C變性30s、56°C退火30s和72°C延伸1min,35個循環(huán); 72°C延伸10min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增片段大小后, 產物使用DNA膠回收試劑盒(上海生物工程技術服務公司)回收目的片段產物。回收的目的片段連接到PMD19-T載體(TaKaRa), 重組質粒轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞(北京全式金生物技術公司), 涂板, 37°C過夜培養(yǎng), 挑取抗氨芐青霉素的陽性克隆, 菌落PCR驗證目的片段符合預期大小后, 送上海生物工程技術服務公司測序。

1.4 CfBI-1基因全長cDNA的獲得

采用巢式PCR和RACE方法擴增基因的3′和5′末端。上述測序結果經(jīng)過BLASTx比對后驗證為CfBI-1基因片段, 根據(jù)其分別設計3′RACE和5′RACE的引物3′F1、3′F2、5′R1、5′R2 (表1)。3′末端首輪PCR反應體系為Premix LA Taq 12.5μL, 引物3′F1 1μL, Oligo(dT)-adapterprimer(dTAP) 2.5μL, 模板cDNA 1μL, 滅菌雙蒸水8μL; 反應程序為: 94°C預變性5min; 94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 1min 30s, 35個循環(huán); 72°C延伸10min。第二輪PCR引物為3′F2和AP(表1), PCR模板為首輪擴增產物, 退火溫度為56°C,其他條件同首輪。5′末端擴增時, 首先使用末端轉移酶在cDNA3′末端加上poly C尾, 以加尾的cDNA為PCR模板; 首輪PCR反應體系為Premix LA Taq 12.5μL, 引物5′R1和Oligo(dG)-adapterprimer(dGAP)(表1)各1μL, 模板1μL, 滅菌雙蒸水9.5μL; 反應程序: 94°C預變性5min; 94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 1min 30s, 35個循環(huán); 72°C延伸10min。次輪PCR引物為5′R2和AP, PCR模板為首輪擴增產物, 退火溫度為58°C, 其他條件同首輪。PCR擴增產物的電泳檢測、回收純化、克隆測序等操作同上述cDNA片段克隆。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5 CfBI-1基因的序列分析和系統(tǒng)進化分析

用Bioedit軟件對上述所獲測序序列進行全長拼接; ORF Finder程序(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)預測開放閱讀框, 并獲得編碼的氨基酸序列; 用SMART程序(http: //smart.embl-heidelberg.de/)進行蛋白結構域的預測; 從GenBank下載小鼠、人、斑馬魚、紫貽貝等物種的BI-1基因的蛋白序列, 用ClustalX程序進行蛋白多序列比對后, 用MEGA5.0程序中的鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)構建基因系統(tǒng)發(fā)生樹。

1.6 干露刺激

將60只暫養(yǎng)一周的櫛孔扇貝放于干燥的玻璃板上, 室溫溫度控制在20°C, 分別在0、2、4、6、8、12、24h隨機取6只扇貝, 取血淋巴, 500g, 4°C, 離心10min, 棄上清, 留血淋巴用于RNA制備。

1.7 脂多糖(LPS)刺激

將100只暫養(yǎng)一周的櫛孔扇貝隨機分為兩組, 每組約50只, 為實驗組和對照組, 分別養(yǎng)殖在兩個水池中。實驗組的扇貝每只注射100μL LPS (0.5mg/mL),對照組的扇貝每只注射100μL滅菌的磷酸鹽緩沖液(PBS)。分別在注射0、3、6、12、24、48、72h從各組隨機取6只扇貝, 取血淋巴, 500g, 4°C, 離心10min,棄上清, 留血淋巴用于RNA制備。

1.8 急性病毒性壞死癥病毒(Acute Viral Necrobiotic Disease Virus, AVNV)刺激

將急性病毒性壞死癥病毒所感染的組織(由黃海水產研究所王崇明老師提供)稱重, 每克組織加9mL的PBS緩沖液, 冰浴研磨勻漿, 4°C, 4000×g離心5min, 將上清液移到新的離心管中, 將沉淀再進行一次研磨, 8000×g離心5min, 將兩次的上清液合并到一個管中, 13000×g離心10min, 澄清的組織勻漿在無菌的條件下, 用2、0.8、0.22μm的濾膜過濾, 將所得到的濾液-20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

將120只櫛孔扇貝隨機分為兩組, 每組約60只,為實驗組和對照組。實驗組的扇貝每只注射100μL的病毒液, 對照組的扇貝每只注射100μL的滅菌的PBS。分別于注射后0、3、6、12、24、48、72h從各組隨機取6只扇貝, 取血淋巴, 500×g, 4°C, 離心10min, 棄上清, 留血淋巴用于RNA制備。

1.9 CfBI-1基因的表達分析

參照Trizol(Invitrogen)說明書提取櫛孔扇貝各組織(血淋巴、鰓、外套膜、閉殼肌、性腺、消化腺)及干露、LPS、病毒刺激實驗樣品的總RNA, 用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara)試劑盒合成一鏈cDNA用于熒光定量表達分析。根據(jù)櫛孔扇貝BI-1基因和內參基因β-actin (GenBank序列號為AAP88387), 分別設計一對熒光定量的引物CfBI-1F′和CfBI-1R′, β-actinF′和β-actinR′ (表1)。熒光定量PCR的反應體系為20μL: 2×SYBR? Premix Ex TaqTM10uL cDNA模板2μL, 熒光定量引物各0.4μL, 50×ROX Reference Dye II 0.4μL, DEPC水6.8μL。每個樣品設置3個重復。反應程序為95°C預變性2min; 95°C 15s, 60°C 25s, 68°C 20s, 40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計算CfBI-1基因的表達量, 并采用SPSS 18.0軟件和SAS 9.1軟件分別進行one-way ANOVA分析和Duncan檢驗, 以P<0.05作為顯著性差異。

2 結果

2.1 CfBI-1基因的全長cDNA序列分析

根據(jù)設計的特異性引物克隆得到CfBI-1基因的部分片段, 然后根據(jù)該片段設計RACE引物進行3′和5′端的擴增, 得到3′和5′末端的序列, 最后拼接得到一條完整的cDNA序列。其全長為957bp (Genbank注冊號為KF913642), 其開放閱讀框(ORF)長度為711bp, 5′非編碼區(qū)(5′-UTR)為48bp, 3′-UTR為195bp,3′-UTR區(qū)含有多腺苷酸化加尾信號aataa (圖1)。CfBI-1基因預測編碼一個含有237個氨基酸的蛋白質, 分子量為27kDa, 結構域預測發(fā)現(xiàn)CfBI-1蛋白含有六個跨膜結構域。

2.2 CfBI-1基因的系統(tǒng)進化分析

將CfBI-1蛋白序列與其他物種的同源蛋白在ClustalX中進行多序列比對分析發(fā)現(xiàn), 櫛孔扇貝BI-1基因與小鼠(Mus musculus)、紫貽貝(Mytilus galloprovincialis)、人(Homo sapiens)、斑馬魚(Danio rerio)及果蠅(Drosophila melanogaster)的BI-1氨基酸同源性分別為48.95%、63.56%、49.37%、49.79%和36.29% (圖2)。使用MEGA軟件構建BI-1氨基酸系統(tǒng)進化樹顯示, 櫛孔扇貝BI-1基因與紫貽貝聚為一支, 之后又與豬蛔蟲(Ascaris suum)和斑馬魚等聚類(圖3)。該基因的系統(tǒng)進化關系與傳統(tǒng)的物種進化地位基本一致。

2.3 CfBI-1基因的表達分析

2.3.1 CfBI-1基因在各組織的表達分析 通過Real-time PCR技術檢測CfBI-1基因在櫛孔扇貝不同組織中的表達情況, 結果顯示, CfBI-1在所檢測的鰓、外套膜、閉殼肌、性腺、消化腺和血淋巴六個組織中均有表達, 且在閉殼肌中表達量最高, 而在血淋巴中表達量最低(圖4)。

圖1 CfBI-1基因cDNA全長及預測的氨基酸序列Fig.1 CfBI-1 full-length cDNA and deduced amino acid sequence

2.3.2 CfBI-1基因在干露刺激下的表達分析Real-time PCR檢測了櫛孔扇貝在干露刺激后不同時間點血淋巴中的BI-1基因的表達變化(圖5)。結果表明: 在干露刺激初期(0—2h), BI-1基因的表達水平?jīng)]有明顯變化; 在干露刺激后4h, BI-1基因的表達水平迅速升高, 達到0h的約3.09倍(P<0.05); 在干露刺激后6h, BI-1基因的表達水平達到最高, 約為0h的25.50倍(P<0.05), 在刺激后期(8—24h), BI-1基因的表達水平略有下降, 但與0h仍有顯著性差異(P<0.05)。

2.3.3 CfBI-1基因在LPS刺激下的表達分析Real-time PCR檢測了櫛孔扇貝在LPS刺激后不同時間點血淋巴中的BI-1基因的表達變化(圖6)。結果表明, 在LPS刺激的過程中, 實驗組與對照組的表達均沒有明顯升高, 并且兩組之間沒有明顯差異。

2.3.4 CfBI-1基因在急性病毒性壞死癥病毒刺激下的表達分析 Real-time PCR檢測了櫛孔扇貝在急性病毒性壞死癥病毒刺激后不同時間點血淋巴中的BI-1基因的表達變化(圖7)。結果表明: 在病毒刺激以后, 實驗組的BI-1基因的表達水平呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢, 在刺激后24h, 實驗組的表達量為對照組的1.82倍(P<0.05), 在病毒刺激后48h實驗組達到最高值, 約為對照組的1.75倍(P<0.05)。

圖2 不同物種BI-1氨基酸序列多重比對分析Fig.2 Multiple alignment of the amino acid sequence of BI-1 among different species

圖3 CfBI-1基因的NJ系統(tǒng)進化樹Fig.3 NJ phylogenetic tree of the CfBI-1 gene sequences

3 討論

圖4 CfBI-1基因在櫛孔扇貝不同組織中的表達Fig.4 Expression levels of CfBI-1 in different tissues of Chlamys farreri

圖5 CfBI-1基因在干露刺激后的表達水平Fig.5 Expression levels of CfBI-1 under air exposure stimulation

圖6 CfBI-1基因在LPS刺激后的表達水平Fig.6 Expression levels of CfBI-1 under lipopolysaccharide(LPS) stimulation

圖7 CfBI-1基因在急性病毒性壞死癥病毒刺激后的表達水平Fig.7 Expression levels of CfBI-1 under acute viral necrobiotic disease virus (AVNV) stimulation

目前, 在水生生物中BI-1基因的研究還比較少,尤其是在貝類中的特點和功能仍有待研究和揭示。本研究首次通過RACE技術獲得了櫛孔扇貝BI-1基因的cDNA序列, 并獲得可能的編碼蛋白序列。同源分析和分子進化聚類分析結果顯示, CfBI-1蛋白序列與其他一些物種BI-1序列具有很高的相似性, 表明該基因在進化上和功能上的高度保守性。BI-1蛋白在哺乳動物和植物中主要定位在細胞的內質網(wǎng)膜、核外膜,蛋白包含多個蘇氨酸磷酸化位點, 但缺乏O-糖基化位點及N-糖基化位點(Xuet al, 1998; Kawai-Yamadaet al, 2001; Bolducet al, 2003), 結構域預測CfBI-1蛋白含有六個跨膜結構域, 表明CfBI-1蛋白在櫛孔扇貝中的細胞定位可能與哺乳動物相同。

BI-1基因不僅在人體心臟、胎盤、腦、肝、肺、骨胳肌等組織中廣泛表達(Adamset al, 1995; Xuet al,1998), 且在多種惡性腫瘤細胞中高度表達, 這與其對凋亡的抑制作用緊密相關(Villalvaet al, 2002;Grzmilet al, 2003)。本研究發(fā)現(xiàn)CfBI-1基因在櫛孔扇貝的鰓、外套膜、閉殼肌、性腺、消化腺和血淋巴六個組織中均有表達, 表明CfBI-1對櫛孔扇貝的正常生命活動起到一定作用, 且表達無明顯的組織特異性; 在閉殼肌中表達量顯著高于其他組織, 表明在閉殼肌中較高濃度的BI-1蛋白抑制細胞凋亡水平對維持閉殼肌正常生理功能可能有重要作用。

為進一步探究CfBI-1基因在櫛孔扇貝中的功能,本研究分別檢測了干露、LPS和急性病毒性壞死癥病毒刺激櫛孔扇貝后CfBI-1基因的表達變化。在干露和病毒刺激以后, 在不同時間點, 表達水平發(fā)生了明顯的升高, 而在LPS刺激以后沒有明顯變化, 說明不同的刺激源引起的細胞應激類型、細胞凋亡程度和凋亡信號通路可能有所不同。干露作為一種物理刺激,主要導致扇貝處于脫水低氧的脅迫狀態(tài), 在干露刺激后4—6h CfBI-1表達即顯著上調, 上調幅度較大,能夠維持至刺激后24h, 說明CfBI-1基因參與了細胞干露應激的響應過程, 干露可能會在較短時間內導致細胞內穩(wěn)變化并啟動凋亡程序。病毒刺激后24、48h CfBI-1表達顯著高于對照, 表明CfBI-1基因參與了病毒介導的免疫反應。Taura綜合癥病毒感染后的南美白蝦中包含BI-1結構域的基因表達量也顯著上調(Zenget al, 2013), 與我們的研究結果類似。但是病毒刺激后CfBI-1上調幅度較小, 72h后表達量開始回落, 推測病毒感染后免疫反應導致的細胞凋亡程度可能低于干露刺激。而在LPS刺激后, 在0—72h內均未觀察到CfBI-1表達變化, 表明CfBI-1對LPS刺激無明顯響應過程。綜上, 我們認為CfBI-1基因參與了干露刺激和急性病毒性壞死癥病毒感染應激過程,在這些刺激所導致的細胞凋亡過程中可能發(fā)揮重要凋亡調節(jié)功能。

致謝 感謝中國水產科學研究院黃海水產研究所王崇明老師提供扇貝急性病毒性壞死癥病毒病料組織。

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