方城縣仔豬大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

蘭振旗 （河南省方城縣畜牧局 473200）

仔豬黃白痢又稱新生豬腹瀉，是仔豬黃痢和仔豬白痢的合稱，都是由埃希氏大腸桿菌在腸道內(nèi)產(chǎn)生毒素所引起的急性腸道傳染病。目前，仔豬黃白痢是常見和多發(fā)的傳染病，特別是仔豬黃痢發(fā)病率高，死亡率高。而仔豬白痢雖發(fā)病率高，死亡率低，但常引起病豬脫水消瘦，如不及時治療，多數(shù)死亡或轉為慢性，即使恢復也成為僵豬。目前，已分離的仔豬黃痢、白痢的血清型眾多，各血清型疫苗之間有效的交叉保護性差，這給黃白痢的防治造成一定難度。并且大腸桿菌對藥物極易產(chǎn)生抗藥性，如青霉素、鏈霉素、土霉素、四環(huán)素、慶大霉素等抗生素幾乎沒有治療作用。因此防治本病時，有條件的地方應進行藥敏試驗選擇敏感藥物，或選用本場過去少用的藥物進行全群給藥，可收到滿意效果。盡早發(fā)現(xiàn)，早期投藥可控制早期感染的病豬，促使痊愈，同時可防止新發(fā)病例的出現(xiàn)。據(jù)不完全統(tǒng)計，在方城縣豬場中，仔豬黃白痢的發(fā)病率在50%左右，死亡率在5%左右，本次試驗即對方城縣范圍內(nèi)仔豬黃白痢的致病菌群進行藥敏試驗，以期對縣內(nèi)養(yǎng)殖戶和豬場的仔豬大腸桿菌病的有效防治提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料的采集 病料來自我縣35個養(yǎng)豬場，共69份樣品，其中15個養(yǎng)殖場豬仔黃痢肛門拭子病料27份，20個養(yǎng)殖場豬仔白痢肛門拭子病料42份。

1.1.2 主要試劑 培養(yǎng)基及細菌鑒定用的生化試劑等方城縣畜牧局疫病測報站實驗室提供。

1.1.3 供試藥片 頭孢噻肟、氟苯尼考、沙拉沙星、慶大霉素等含藥紙片。

1.1.4 試驗動物 清潔級昆明系小白鼠雌雄各半，共10只。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離培養(yǎng) 從養(yǎng)豬場采集患有黃白痢豬仔的肛門拭子病料，將其浸入到滅菌生理鹽水中，充分洗脫，將其懸浮液分別劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，然后挑取麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的粉紅色、表面光滑的31個單個菌落分別接種到營養(yǎng)瓊脂斜面上，37℃培養(yǎng)24h后，置冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌體形態(tài)觀察 將上述培養(yǎng)基上所得的菌落進行涂片，革蘭氏染色，鏡檢，觀察細菌形態(tài)以及染色特征，將符合大腸桿菌形態(tài)特征的進行生化試驗，否則棄之。

1.2.3 生化試驗 將上述分離出的純培養(yǎng)物進行糖發(fā)酵試驗、吲哚試驗、MR試驗、VP試驗、枸櫞酸鹽試驗，觀察其變化并記錄結果。

1.2.4 致病性試驗 將符合生化反應符合大腸桿菌特性的菌株接種營養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18h后，用生理鹽水洗下菌落制成菌懸液。將小白鼠隨機分為兩組，其中一組每只皮下注射0.2ml菌懸液，另一組注射相同劑量的無菌生理鹽水。將24～48h左右死亡的小鼠立即解剖，并且用接種環(huán)取其心血接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，并對分離出的菌株進行進一步鑒定。

1.2.5 藥敏性試驗 將稀釋好的菌液每個平板接種0.1ml，使菌液鋪滿整個平板，待平板干后，用無菌鑷子取各種藥片貼于平板上，每個平板5張藥片，每個藥片之間的距離不小于3cm，將貼好藥片的平板置于37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24h后觀察實驗結果并測出個藥片的抑菌圈直徑，并按照標準判定敏感，中度敏感和耐藥情況。

2 結果

2.1 分離培養(yǎng)特性 在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上均呈粉紅色、光滑濕潤、邊緣整齊的菌落；在普通瓊脂培養(yǎng)基上呈灰白色、圓形、整齊、隆起、光滑濕潤的菌落，與大腸桿菌的形態(tài)特征相符。

2.2 染色鏡檢 分離菌株革蘭氏染色為陰性小桿菌，兩端鈍圓，多單個存在，與大腸桿菌染色特性相符。

2.3 生化鑒定 分離出的菌株均能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇，均能產(chǎn)酸產(chǎn)氣，大多數(shù)菌株不利用蔗糖，少數(shù)緩慢發(fā)酵，VP實驗、枸櫞酸鹽試驗均為陰性，吲哚試驗、MR試驗均為陽性，以上試驗結果可證明分離出的菌株為大腸桿菌。

2.4 致病性試驗 試驗組的小白鼠在接種后出現(xiàn)精神萎靡，進而出現(xiàn)稀瀉等臨床癥狀，接種10h后開始死亡，24h內(nèi)全部死亡，解剖死小白鼠，均能見其內(nèi)臟充滿淤血，肝臟腫大，并且在心血和肝臟中能分離出大腸桿菌，而對照組的小白鼠無明顯變化，由此可見，從豬仔肛門處分離出的大腸桿菌具有較強的致病性。

2.5 藥敏性試驗 對分離出的菌株進行藥敏性試驗，其結果如附表所示。

結果表明，分離菌對慶大霉素、卡那霉素、阿莫西林、頭孢唑啉、氨芐青霉素、氟苯尼考、培氟沙星、淋必治、復方新諾明、強力霉素10種藥物具有的耐藥性，對沙拉沙星、阿奇霉素、頭孢拉啶、福利平4種藥物較為敏感，對其余的藥物中度敏感。

3 討論

（1）通過以上實驗研究可以證明從豬場分離的31株菌株，經(jīng)培養(yǎng)特性、形態(tài)、生化試驗、致病性試驗表明均為致病性大腸桿菌，而且有較強的致病性。（2）藥敏試驗結果表明31株大腸桿菌分離菌株對慶大霉素、卡那霉素、阿莫西林、頭孢唑啉、氨芐青霉素、氟苯尼考、培氟沙星、淋必治、復方新諾明、強力霉素10種藥物具有的耐藥性，對沙拉沙星、阿奇霉素、頭孢拉啶、福利平4種藥物較為敏感，對其余的藥物中度敏感，這為預防和治療該病提供了理論依據(jù)。從研究結果也可以看出分離的致病性大腸桿菌對很多藥物產(chǎn)生了較強的耐藥性，這可能是因為這些豬場的豬長期服用這些藥物從而產(chǎn)生了耐藥性，因此飼養(yǎng)員在給豬用藥時要合理搭配，不能長期服用一種或幾種藥物，要定期更換，以免產(chǎn)生耐藥性，而且還應該定期進行藥敏性試驗，以便指導臨床用藥。（3）防治措施：通過使用敏感藥物沙拉沙星、阿奇霉素、頭孢拉啶、福利平進行仔豬大腸桿菌病的治療，取得了理想的效果。但是在部分豬場不能很好地控制該病，這與臨床上濫用抗生素關系密切，導致了大腸桿菌的耐藥性。目前防治仔豬大腸桿菌病所采取的措施之一是給臨產(chǎn)母豬注射大腸桿菌多價菌苗，即在母豬臨產(chǎn)前15d和45d各注射1次大腸桿菌多價菌苗。但注射菌苗后所產(chǎn)仔豬仍發(fā)生仔豬黃白痢，表明引起仔豬黃自痢的大腸桿菌血清型與其所用菌苗的血清型不一致。豬場應根據(jù)本場的實際情況，制備自家仔豬大腸桿菌鋁膠滅活苗，免疫母豬，以此來獲得較好的預防效果。仔豬大腸桿菌病要綜合防范，除了用自家苗免疫母豬外，還要提高仔豬抵抗力，搞好母豬和產(chǎn)房環(huán)境衛(wèi)生，嚴格執(zhí)行消毒制度，搞好豬瘟等重大疫病的基礎免疫工作，只有這樣才能較好的預防并減少仔豬大腸桿菌病的發(fā)生。

附表 分離菌株的藥物敏感性試驗結果 (mm)

[1]蘭羅勛.仔豬腹瀉綜合防治初探, 畜牧獸醫(yī)雜志[J].2006, 25(6): 80-82.

[2]金柏新.仔豬腹瀉與大腸桿菌藥敏試驗[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊.1995(6): 24.

[3]王尚榮.不同藥物對斷奶仔豬腹瀉的療效研究[J].中國獸藥雜志.2006, 40(12): 51-53.