針藥結合對實驗性腦缺血大鼠缺血區Bax、Bcl-2 的影響*

馮曉紅，王 蕾，王秀云，張果忠

(1.天津中醫藥大學，天津300193 ; 2.天津武警醫學院，天津300162)

腦血管病中腦梗死占大多數，其中大腦中動脈分布區的發病率最高。本課題組在前期工作中發現:井穴放血法可提高腦梗塞大鼠存活率及減小梗死面積［1-2］。為進一步探索針藥結合對實驗性腦缺血大鼠細胞凋亡的影響，筆者采用免疫組化法對腦缺血大鼠缺血區Bcl-2、Bax 的表達進行了觀察，總結報道如下。

1 材料與方法

1.1 動 物

SPF 級健康成年雄性Wistar 大鼠，體質量220 ～250 g，由軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所動物實驗中心提供，許可證編號:SCXK -(軍)2009 -003。

1.2 藥 品

安宮牛黃丸，由北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠提供，批號1017031;尼莫地平，由天津市中央藥業有限公司提供，批號110704。

1.3 永久性大腦中動脈栓塞模型的建立

參照Longa 法，并稍作改良:以質量分數100 g/L 的水合氯醛按350 ～400 μg/g 體質量腹腔麻醉;分離左側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈;頸總動脈近心端5-0 絲線結扎，頸內動脈處預置5 -0絲線扎活扣備用，在活扣的遠心端用動脈夾夾閉頸總動脈;在頸總動脈距分叉部1 ～2 mm 處用眼科剪剪1 個小口，緩慢插入線栓(直徑約為0.37 mm 魚線，頭端為鈍頭，用指甲油處理)，迅速去掉動脈夾并將活扣扎緊;緩慢插線栓，直到遇到阻力為止，插入深度距分叉處(18 ± 0. 5)mm，將活扣處結扎1 次;記錄栓塞時間;再次結扎頸總動脈近心端，并固定線栓暴露部分，留鼠體內約3 mm，其余剪除;清理傷口，縫合后使用結晶磺胺于傷口處消毒、抗感染。

1.4 針刺選穴

選取手十二井穴。穴位定位:采用比較解剖學，參考人體相應穴位解剖標志，在大鼠前肢各趾的相應部位選取，即取位于大鼠雙側前肢趾端的少商、商陽、中沖、關沖、少沖、少澤，每側6 個穴位，共12 個。

1.5 分組與處理

將大鼠隨機分為正常對照組、假手術組、模型對照組和治療組(分手十二井穴放血組、安宮牛黃丸組、針藥結合組、尼莫地平組，各組又分為缺血6 h、24 h、48 h、72 h 4 個時間段)。除正常對照組、假手術組每組5 只動物外，其余每組10 只。

正常對照組:同樣抓取，不進行任何處理。假手術組:分離一側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，縫合消毒。模型對照組:大鼠大腦中動脈栓塞造模，不予治療。十二井穴放血組:用處理后的采血針于大鼠雙側前肢端的十二井穴點刺放血，出血量以血盡為止。安宮牛黃丸組:按0.25 g/kg 體質量灌胃給藥。針藥結合組:井穴放血+安宮牛黃丸灌胃。尼莫地平組:按0.1g/kg 體質量灌胃給藥。井穴放血，每天放血2 次;藥物灌胃，每天1 次。

1.6 檢測指標

每組大鼠于各時間點分別灌注、取腦、制作石蠟切片，用免疫組化法檢測Bax、Bcl-2 的表達。免疫組織化學染色法嚴格按照操作程序進行。采用Mias 圖像處理系統，每只大鼠各取1 張免疫組化切片，在梗死灶周邊區隨機取5 個視野，對Bax、Bcl-2表達進行觀察及分析。

1.7 統計學方法

2 結 果

各組大鼠腦組織Bax、Bcl-2 陽性細胞數及Bcl-2/Bax 對比結果見表1 ～3。①與模型對照組對比，缺血6 h，各組Bax、Bcl-2 陽性細胞數除尼莫地平組外，差別均有統計學意義(P ＜0.01)。從比值來看，針藥結合組效果顯著，井穴放血組和安宮牛黃丸組次之，但組間對比差別無統計學意義(P ＞0.05)。說明針藥結合組在中風初期抑制細胞凋亡效果顯著。②缺血24 h 時，與模型對照組對比，除尼莫地平組外，其他各組Bax 陽性細胞數明顯減少，差別均有統計學意義(P ＜0.01);各組Bcl-2 陽性細胞與模型對照組對比，差別均有統計學意義(P ＜0.01)。從比值來看，針藥結合效果最佳，井穴放血組次之。③缺血48 h 時，與模型對照組對比，其余各組Bcl-2陽性細胞數增多，差別均有統計學意義(P ＜0.01);Bax 陽性細胞數減少，只有假手術組和尼莫地平組差別有統計學意義(P ＜0.01)。從比值來看，針藥結合組效果最佳，但與48 h 之前相比，比值下降，其余各治療組對比，差異無統計學意義(P ＞0．05)。說明超出時間窗，針藥結合治療效果下降，抑制細胞凋亡能力減弱。④缺血72 h 時，與模型對照組對比，除安宮牛黃丸組外，其余各組Bax 陽性細胞數減少，差別均有統計學意義(P ＜0.01);假手術組Bcl-2 陽性細胞數減少，各治療組增多，差別有統計學意義(P ＜0.01)。結果表明:從比值來看，中醫藥各治療組與尼莫地平組對比，差別均無統計學意義(P ＞0．05)。說明在腦缺血48 h 之后，各種治療手段效果都不顯著，但仍優于模型對照組。

表1 各組大鼠腦組織Bax 陽性細胞數對比

表1 各組大鼠腦組織Bax 陽性細胞數對比

注:與同時段的模型對照組對比，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01;與同時段的針藥結合組對比，# P ＜0.05，## P ＜0.01;與同時段的尼莫地平組對比，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。

組 別 動物數6 h 24 h 48 h 72 h正常對照組 5 0.60±0.84＊＊假手術組 5 0.80±1.03＊＊ 0.62±1.29＊＊ 0.39±0.25＊＊ 0.9±1.04＊＊模型對照組 10 42.30±2.87 40.60±3.34 40.00±3.27 41.80±4.42安宮牛黃丸組 10 34.80±4.32＊＊## 32.30±3.13＊＊#△△ 38.40±3.89 38.1±4.15* #井穴放血組 10 34.00±2.87＊＊##△ 34.00±1.76＊＊#△ 38.90±3.25 39.00±2.62#針藥結合組 10 31.00±2.79＊＊△△ 31.20±5.16＊＊△△ 37.10±3.45 41.00±4.52尼莫地平組 10 40.80±3.26 40.60±4.17 39.0±4.22＊＊ 38. ±3.33＊＊

表2 各組大鼠腦組織Bcl-2 陽性細胞數對比

表2 各組大鼠腦組織Bcl-2 陽性細胞數對比

注:與同時段的模型對照組對比，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01;與同時段的針藥結合組對比，# P ＜0.05，## P ＜0.01;與同時段的尼莫地平組對比，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。

組 別 動物數6 h 24 h 48 h 72 h正常對照組 5 1.70±0.95＊＊假手術組 5 1.60±1.17＊＊ 1.25±0.1＊＊ 0.69±1.91＊＊ 1.04±0.21＊＊模型對照組 10 19.30±4.35 13.70±3.40 16.40±3.86 17.00±2.58安宮牛黃丸組 10 23.80±3.71＊＊# 22.00±3.74＊＊## 25.0±2.83＊＊# 25.3±2.26＊＊井穴放血組 10 23.90±4.41＊＊# 23.90±3.38＊＊## 26.1±4.95＊＊#△ 24.9±4.18＊＊針藥結合組 10 25.70±3.06＊＊△△ 26.00±4.08＊＊△△ 27.4±3.89＊＊ ＊＊△ 26.4±4.62＊＊尼莫地平組 10 21.20±3.29 21.80±3.08＊＊ 23.4±4.70＊＊ 25.1±2.51＊＊

表3 各組大鼠腦組織Bcl-2/Bax 對比

3 討 論

目前認為:Bcl-2 表達是抑制凋亡的一個關鍵因素，可通過直接抑制線粒體對細胞色素C 的通透性增高，抑制Bid 和Bax 介導的細胞色素C 釋放，間接抑制caspase 前體的激活，從而阻斷細胞凋亡的發生。Bax 是和Bcl-2 類似的蛋白，但兩者作用完全相反。當細胞受到死亡信號刺激后，Bax 發生構象變化，與抗凋亡蛋白發生相互作用，使線粒體膜通透性發生改變，釋放細胞色素C，并與凋亡蛋白酶激活因子1 結合，順序激活Caspase-9、Castpase-3，最終導致細胞凋亡［3］。高表達的Bcl-2 可使去除神經生長因子的交感神經元繼續存活，而Bax 的過度表達則能對抗Bcl-2 對細胞凋亡的抑制作用。當Bcl-2 與Bax結合，形成Bcl-2/Bax 異二聚體時，可阻止Bax 插入線粒體外膜［4-5］，保護線粒體電勢梯度，調節細胞內的自穩狀態和氧化還原狀態等，從多個方面抑制凋亡發生;但當Bcl-2 與Bax 的結合點斷裂，則Bcl-2對細胞的保護性消失，說明Bcl-2 必須結合Bax 才能發揮其作用［6］。

腦缺血-再灌注后對腦的保護治療能夠恢復正常神經功能的缺血半暗帶內神經組織的存活時間段常被稱為腦的保護治療“時間窗”［7］。本實驗研究發現:大鼠海馬區Bcl-2 表達于缺血后6 h 時明顯增加，48 h 時達高峰，以后趨于平穩。Bcl-2 表達增加的時程和腦缺血耐受產生的時間窗基本吻合［8］，提示Bcl-2 表達增加可能是缺血后干預產生腦保護作用的重要機制。腦缺血早期Bcl-2 表達相對增強，隨著腦缺血時間的延長，促凋亡蛋白Bax 的表達逐漸相對增強，神經細胞開始出現凋亡的形態學改變。Bcl-2 與Bax 的比值對決定細胞凋亡起關鍵作用，比值增大時促進細胞存活，反之則導致細胞死亡［9］。本實驗中，安宮牛黃丸組和井穴放血組在腦缺血后6，24，48，72 h 4 個時段Bax、Bcl-2 比值無明顯變化，但均高于模型對照組，且在6，24 h 時高于尼莫地平對照組;針藥結合組在腦缺血后6，24 h Bcl-2、Bax比值最大，此表明:在腦缺血早期，安宮牛黃丸和井穴放血相結合治療急性缺血性中風效果最佳，能有效地抑制細胞凋亡，但在缺血后48，72 h，尼莫地平對照組Bcl-2、Bax 比值超過了井穴放血組、安宮牛黃丸組和針藥結合組，效果相對較好。可見超過時間窗后，傳統中醫療法抑制細胞凋亡能力下降，正如古籍中描述安宮牛黃丸“無論陰閉、陽閉，唯需早用”，且安宮牛黃丸含有重金屬，對大鼠的耐受水平也是一種考驗，故安宮牛黃丸不宜久服。

此外，實驗還發現:在缺血干預后變化幅度方面，Bax 表達較小，Bcl-2 卻明顯較大，兩者比值增高。此現象意味著缺血后干預可能通過上調Bcl-2表達，減輕神經細胞凋亡，產生腦保護作用，而Bax在此過程中不起重要作用。此結果有待今后進一步驗證。

［1］王秀云，劉公望，郭義，等.井穴刺絡放血法對MCAO 模型大鼠大腦皮層HSP70 蛋白表達的影響［J］. 天津中醫藥，2005，22(6):477 -478.

［2］王秀云，劉公望，郭義，等. 手十二井穴刺絡放血法對MCAO 模型大鼠大腦皮層c-fos 蛋白表達的影響［J］.上海針灸雜志，2004，23(12):39 -41.

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