雙黃連及清開(kāi)靈對(duì)耐藥大腸埃希菌質(zhì)粒的消除作用及對(duì)β-內(nèi)酰胺酶活性的影響

雷 云

（湖北省武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430064）

在臨床疾病治療中，對(duì)于抗生素的應(yīng)用若是不合理，不僅將提高細(xì)菌的耐藥性，也將給疾病抗感染治療帶來(lái)一定挑戰(zhàn)；針對(duì)β-內(nèi)酰胺酶 (ESBLs)引起的耐藥問(wèn)題，采用中藥抗感染治療方式，也將會(huì)發(fā)揮重要作用。以下就對(duì)探討臨床中中藥雙黃連及清開(kāi)靈對(duì)耐藥大腸埃希菌質(zhì)粒的消除作用及對(duì)β-內(nèi)酰胺酶 (ESLs)活性的影響，具體內(nèi)容如下所示。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采用由我院臨床送檢的痰標(biāo)本[1]，并篩查大腸埃希菌ESBLs，按照美國(guó)臨床、實(shí)驗(yàn)室 (CLSI/NCCLS)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)，選取ESBLs陽(yáng)性的大腸埃希菌。還將應(yīng)用質(zhì)粒提取試劑盒 (生產(chǎn)廠家：OMEGA公司，產(chǎn)品型號(hào)：D6943-01)，還有Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒 (生產(chǎn)廠家：Solarbio公司，產(chǎn)品型號(hào)：Pc0010)，清開(kāi)靈注射液 (生產(chǎn)廠家：神威藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：Z10930010)，頭孢他啶 (生產(chǎn)廠家：齊魯制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20010255)，雙黃連粉針劑 (生產(chǎn)廠家：哈藥集團(tuán)中藥二廠生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字：Z20043425)藥物。在實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng) (生產(chǎn)廠家：美國(guó)BD公司，產(chǎn)品型號(hào)：PHOENIX100)、凝膠成像儀 (生產(chǎn)廠家：北京興達(dá)恒信科技有限公司，產(chǎn)品型號(hào)：Bio-Best)、全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀 (生產(chǎn)廠家：歐洲Tecan公司，產(chǎn)品型號(hào)：Infinite M1000)、紫外分光光度計(jì) (生產(chǎn)廠家：北京鈕因華信科技發(fā)展有限公司，產(chǎn)品型號(hào)：UV2400)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 試驗(yàn)組中，測(cè)定藥物最低抑菌濃度，參照肉湯稀釋法以肉眼觀察無(wú)試管中的最低藥物濃度值；在質(zhì)粒消除實(shí)驗(yàn)中，將實(shí)驗(yàn)菌株轉(zhuǎn)種到含有1/2MIC濃度中藥的M-H肉湯中培養(yǎng)24h之后，用生理鹽水將其洗滌后重懸浮，并調(diào)整OD值濃度到1.0，吸取瓶中5mL的菌液。然后，就可按質(zhì)粒提取盒上面的操作步驟，對(duì)0.01mL質(zhì)粒溶液進(jìn)行10倍稀釋，并分別在260nm和280nm波長(zhǎng)下用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其OD值[2]。將經(jīng)中藥處理后的菌株轉(zhuǎn)種到M-H瓊脂培養(yǎng)基上，選取在抗生素培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)菌株，以及在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株，并把消除子轉(zhuǎn)種在M-H肉湯中，放在37℃環(huán)境中振搖培養(yǎng)；經(jīng)1%瓊脂糖電泳后EB染色，再在紫外凝膠成像儀下分析中藥雙黃連及清開(kāi)靈處理前后的質(zhì)粒消除情況。β-內(nèi)酰胺酶活性測(cè)定中，將獲得的菌體用磷酸鹽緩沖液 (PBS)洗滌，在4℃環(huán)境下重懸在PBS緩沖液中預(yù)冷，需要在100W條件下進(jìn)行超聲破碎3min，吸取上清，用Bradford方法進(jìn)行蛋白定量。觀察組中，質(zhì)粒消除中，選用十二烷基磺酸鈉(SDS)做對(duì)照實(shí)驗(yàn)，用不經(jīng)處理菌株作空白對(duì)照，選用舒巴坦 (30mg/L)檢驗(yàn)β-內(nèi)酰胺酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SSPS12.0簡(jiǎn)體中文網(wǎng)絡(luò)版軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[3]，研究所涉及到的計(jì)量資料用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)P＜0.05為差異具有 “顯著”意義；P＞0.05，差異無(wú)意義。

2 結(jié)果

對(duì)于兩組試驗(yàn)后，藥物MIC測(cè)定結(jié)果中，雙黃連、清開(kāi)靈對(duì)菌株MIC為125mL/L，經(jīng)雙黃連以及清開(kāi)靈作用后，菌液質(zhì)粒濃度產(chǎn)生一定的變化，降低質(zhì)粒濃度，可見(jiàn)雙黃連及清開(kāi)靈對(duì)ESBLs大腸埃希菌質(zhì)粒有消除作用;且在β-內(nèi)酰胺酶活性測(cè)定中，經(jīng)雙黃連及清開(kāi)靈作用后，細(xì)菌β-內(nèi)酰胺酶活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。兩組具體數(shù)據(jù)如下表1中所示。

表1 兩組β-內(nèi)酰胺酶活性對(duì)比

3 討論

近年來(lái)，針對(duì)ESBLs大腸埃希菌引起耐藥問(wèn)題，提高治療中人體對(duì)敏感菌株的耐藥性[4]，并通過(guò)特異性整合之后，還可在質(zhì)粒上使得耐藥基因群聚，提升細(xì)菌的多重耐藥性；并且，在β-內(nèi)酰胺酶中，還可以通過(guò)水解、非水解的方式破壞β-內(nèi)酰胺環(huán)，從而將會(huì)滅活青霉素與頭孢菌素類抗生素，使患者細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性，使許多抗生素失效。在臨床感染性疾病治療中，作為清熱解毒類藥物，雙黃連與清開(kāi)靈發(fā)揮一定治病療效作用，不僅可以抑制肺炎雙球菌、乙型溶血性鏈球菌、銅綠假單胞菌，還具有廣譜抗菌作用，同時(shí)也具備消除細(xì)菌耐藥性的潛能。

在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中研究顯示，雙黃連、清開(kāi)靈可延長(zhǎng)感染體存活時(shí)長(zhǎng)，減輕患者菌血癥癥狀，減輕感染體的臟器病理?yè)p傷，縮短臨床治療病程，有效提高臨床治療效果[5]。應(yīng)用雙黃連、清開(kāi)靈治療感染性的疾病，可以抑制大腸埃希菌的協(xié)同作用，能夠使不敏感細(xì)菌轉(zhuǎn)化為敏感菌，消除ES-BLs大腸埃希菌R質(zhì)粒，抑制β-內(nèi)酰胺酶活性

臨床上，針對(duì)耐藥ESBLs大腸埃希菌，可以應(yīng)用中藥方式消除細(xì)菌耐藥質(zhì)粒，降低耐藥性，降低β-內(nèi)酰胺酶活性。應(yīng)用中藥雙黃連與清開(kāi)靈可以通過(guò)抑制外排泵作用，通過(guò)天然耐藥和獲得性耐藥兩種機(jī)制，細(xì)菌固有的抵抗抗菌藥的能力，對(duì)抗菌藥產(chǎn)生耐藥，改變膜通透性阻滯藥物進(jìn)入，消除質(zhì)粒，消除細(xì)菌耐藥性，黃連提取物，還可抑制細(xì)菌外排泵作用，恢復(fù)外膜通道蛋白表達(dá)，抑制細(xì)菌耐藥質(zhì)粒。采取雙黃連中藥，可以清熱解毒、清熱燥濕，對(duì)直接消除質(zhì)粒，提高了中藥消除劑效果具有一定的作用。雙黃連中具備中藥消除R質(zhì)粒，以中藥黃連提取物作為質(zhì)粒消除劑，可以消除體外R質(zhì)粒，提高消除率。其中，清開(kāi)靈注射劑，對(duì)部分革蘭陰性桿菌亦具有抗菌活性，是由膽酸、珍珠母 （粉）、豬去氧膽酸、梔子、水牛角 （粉）、板藍(lán)根、黃芩苷和金銀花制備的中藥復(fù)方制劑；具有清熱解毒、化痰通絡(luò)、醒神開(kāi)竅的功效。

由上可知，臨床中，中藥雙黃連與清開(kāi)靈可以消除耐藥大腸埃希菌質(zhì)粒，抑制β-內(nèi)酰胺酶活性，相較于常規(guī)西醫(yī)方法，具有很好的臨床效果，值得推廣。

[1]何明，吳崢嶸，李淵.雙黃連、清開(kāi)靈對(duì)耐藥大腸埃希菌R質(zhì)粒及β-內(nèi)酰胺酶的影響[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，(2)，pp.105-108.

[2]曹穎.雙黃連及清開(kāi)靈對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌抑菌作用的研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2011.

[3]吳崢嶸.雙黃連粉針劑對(duì)多重耐藥大腸埃希菌耐藥性影響的機(jī)理研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2013.

[4]張志堅(jiān).河南地區(qū)大腸埃希菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的研究[D].鄭州：鄭州大學(xué)，2010.

[5]張春輝.致病性大腸埃希菌ESBLs基因檢測(cè)與耐藥性控制[D].西安：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2011.