雙黃連及清開靈對耐藥大腸埃希菌質粒的消除作用及對β-內酰胺酶活性的影響

雷 云

（湖北省武漢科技大學附屬天佑醫院檢驗科，武漢 430064）

在臨床疾病治療中，對于抗生素的應用若是不合理，不僅將提高細菌的耐藥性，也將給疾病抗感染治療帶來一定挑戰；針對β-內酰胺酶 (ESBLs)引起的耐藥問題，采用中藥抗感染治療方式，也將會發揮重要作用。以下就對探討臨床中中藥雙黃連及清開靈對耐藥大腸埃希菌質粒的消除作用及對β-內酰胺酶 (ESLs)活性的影響，具體內容如下所示。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采用由我院臨床送檢的痰標本[1]，并篩查大腸埃希菌ESBLs，按照美國臨床、實驗室 (CLSI/NCCLS)標準進行檢驗，選取ESBLs陽性的大腸埃希菌。還將應用質粒提取試劑盒 (生產廠家：OMEGA公司，產品型號：D6943-01)，還有Bradford蛋白濃度測定試劑盒 (生產廠家：Solarbio公司，產品型號：Pc0010)，清開靈注射液 (生產廠家：神威藥業有限公司，國藥準字：Z10930010)，頭孢他啶 (生產廠家：齊魯制藥有限公司，國藥準字：H20010255)，雙黃連粉針劑 (生產廠家：哈藥集團中藥二廠生產，國藥準字：Z20043425)藥物。在實驗中，應用全自動微生物鑒定藥敏分析系統 (生產廠家：美國BD公司，產品型號：PHOENIX100)、凝膠成像儀 (生產廠家：北京興達恒信科技有限公司，產品型號：Bio-Best)、全波長多功能酶標儀 (生產廠家：歐洲Tecan公司，產品型號：Infinite M1000)、紫外分光光度計 (生產廠家：北京鈕因華信科技發展有限公司，產品型號：UV2400)。

1.2 實驗方法 試驗組中，測定藥物最低抑菌濃度，參照肉湯稀釋法以肉眼觀察無試管中的最低藥物濃度值；在質粒消除實驗中，將實驗菌株轉種到含有1/2MIC濃度中藥的M-H肉湯中培養24h之后，用生理鹽水將其洗滌后重懸浮，并調整OD值濃度到1.0，吸取瓶中5mL的菌液。然后，就可按質粒提取盒上面的操作步驟，對0.01mL質粒溶液進行10倍稀釋，并分別在260nm和280nm波長下用紫外分光光度計測量其OD值[2]。將經中藥處理后的菌株轉種到M-H瓊脂培養基上，選取在抗生素培養基上不生長菌株，以及在普通培養基上生長的菌株，并把消除子轉種在M-H肉湯中，放在37℃環境中振搖培養；經1%瓊脂糖電泳后EB染色，再在紫外凝膠成像儀下分析中藥雙黃連及清開靈處理前后的質粒消除情況。β-內酰胺酶活性測定中，將獲得的菌體用磷酸鹽緩沖液 (PBS)洗滌，在4℃環境下重懸在PBS緩沖液中預冷，需要在100W條件下進行超聲破碎3min，吸取上清，用Bradford方法進行蛋白定量。觀察組中，質粒消除中，選用十二烷基磺酸鈉(SDS)做對照實驗，用不經處理菌株作空白對照，選用舒巴坦 (30mg/L)檢驗β-內酰胺酶活性。

1.3 統計學處理 采用SSPS12.0簡體中文網絡版軟件對所有數據進行統計分析[3]，研究所涉及到的計量資料用t檢驗，計數資料以χ2檢驗，檢驗水準P＜0.05為差異具有 “顯著”意義；P＞0.05，差異無意義。

2 結果

對于兩組試驗后，藥物MIC測定結果中，雙黃連、清開靈對菌株MIC為125mL/L，經雙黃連以及清開靈作用后，菌液質粒濃度產生一定的變化，降低質粒濃度，可見雙黃連及清開靈對ESBLs大腸埃希菌質粒有消除作用;且在β-內酰胺酶活性測定中，經雙黃連及清開靈作用后，細菌β-內酰胺酶活性降低，差異有統計學意義 (P＜0.05)。兩組具體數據如下表1中所示。

表1 兩組β-內酰胺酶活性對比

3 討論

近年來，針對ESBLs大腸埃希菌引起耐藥問題，提高治療中人體對敏感菌株的耐藥性[4]，并通過特異性整合之后，還可在質粒上使得耐藥基因群聚，提升細菌的多重耐藥性；并且，在β-內酰胺酶中，還可以通過水解、非水解的方式破壞β-內酰胺環，從而將會滅活青霉素與頭孢菌素類抗生素，使患者細菌產生抗藥性，使許多抗生素失效。在臨床感染性疾病治療中，作為清熱解毒類藥物，雙黃連與清開靈發揮一定治病療效作用，不僅可以抑制肺炎雙球菌、乙型溶血性鏈球菌、銅綠假單胞菌，還具有廣譜抗菌作用，同時也具備消除細菌耐藥性的潛能。

在動物實驗中研究顯示，雙黃連、清開靈可延長感染體存活時長，減輕患者菌血癥癥狀，減輕感染體的臟器病理損傷，縮短臨床治療病程，有效提高臨床治療效果[5]。應用雙黃連、清開靈治療感染性的疾病，可以抑制大腸埃希菌的協同作用，能夠使不敏感細菌轉化為敏感菌，消除ES-BLs大腸埃希菌R質粒，抑制β-內酰胺酶活性

臨床上，針對耐藥ESBLs大腸埃希菌，可以應用中藥方式消除細菌耐藥質粒，降低耐藥性，降低β-內酰胺酶活性。應用中藥雙黃連與清開靈可以通過抑制外排泵作用，通過天然耐藥和獲得性耐藥兩種機制，細菌固有的抵抗抗菌藥的能力，對抗菌藥產生耐藥，改變膜通透性阻滯藥物進入，消除質粒，消除細菌耐藥性，黃連提取物，還可抑制細菌外排泵作用，恢復外膜通道蛋白表達，抑制細菌耐藥質粒。采取雙黃連中藥，可以清熱解毒、清熱燥濕，對直接消除質粒，提高了中藥消除劑效果具有一定的作用。雙黃連中具備中藥消除R質粒，以中藥黃連提取物作為質粒消除劑，可以消除體外R質粒，提高消除率。其中，清開靈注射劑，對部分革蘭陰性桿菌亦具有抗菌活性，是由膽酸、珍珠母 （粉）、豬去氧膽酸、梔子、水牛角 （粉）、板藍根、黃芩苷和金銀花制備的中藥復方制劑；具有清熱解毒、化痰通絡、醒神開竅的功效。

由上可知，臨床中，中藥雙黃連與清開靈可以消除耐藥大腸埃希菌質粒，抑制β-內酰胺酶活性，相較于常規西醫方法，具有很好的臨床效果，值得推廣。

[1]何明，吳崢嶸，李淵.雙黃連、清開靈對耐藥大腸埃希菌R質粒及β-內酰胺酶的影響[J].北京中醫藥大學學報，2012，(2)，pp.105-108.

[2]曹穎.雙黃連及清開靈對產ESBLs大腸埃希菌抑菌作用的研究[D].北京：北京中醫藥大學，2011.

[3]吳崢嶸.雙黃連粉針劑對多重耐藥大腸埃希菌耐藥性影響的機理研究[D].北京：北京中醫藥大學，2013.

[4]張志堅.河南地區大腸埃希菌產超廣譜β-內酰胺酶的研究[D].鄭州：鄭州大學，2010.

[5]張春輝.致病性大腸埃希菌ESBLs基因檢測與耐藥性控制[D].西安：西北農林科技大學，2011.