多參數流式細胞術檢測91例急性白血病免疫表型分析

李珊鳳，易漢杰，金明威，陳哲，陳穎，王建華，孫偉亮，裴仁治

多參數流式細胞術檢測91例急性白血病免疫表型分析

李珊鳳，易漢杰，金明威，陳哲，陳穎，王建華，孫偉亮，裴仁治

目的探討多參數流式細胞術檢測急性白血病（AL）免疫表型的特點，同時與形態學分型對比以提高急性白血病實驗室診斷水平。方法對就診91例AL采用骨髓細胞形態學、骨髓細胞化學染色和細胞免疫表型分型檢測方法。結果91例AL中，59例急性髓系白血病（AML）表達CD13、CD33、CD15、MPO、CD117、CD34和HLA-DR陽性率分別為93.2%、76.2%、55.9%、79.6%、89.8%、61%和62.7%；32例急性淋巴細胞白血病（ALL）中8例T-ALL表達CD2、CD3、CD5、CD7、CD4、CD8、cCD3、CD34和HLA-DR陽性率分別為75%、50%、75%、100%、25%、37.5%、100%，50%和62.5%；24例B-ALL表達CD10、CD19、CD20、CD22、CyCD79a、CD34和HLA-DR陽性率分別為45.8%、100%、33.3%、70.8%、75%、100%和62.5%。FAB分型有54例AML、29例ALL和8例AL不能分型。8例AL經免疫分型確診為5例AML，1例T-ALL，2例B-ALL；另證實1例T/B混合型急性白血病和1例雙表型急性白血病。結論AL免疫表型分析能進一步明確AL診斷，并可獲得白血病細胞不同分化階段的參數，對AL的診斷和預后判斷具有重要意義，對形態學分型具有補充和修正。

白血病，急性；流式細胞術；形態學分型；免疫表型分型

急性白血病（acute leukemia，AL）是一組高度異質性惡性疾病，臨床表現不典型和形態學多樣化等特點是導致AL誤診的主要原因[1]。迄今，AL實驗室診斷與分型主要依靠形態學及細胞化學染色分析，而形態學診斷準確率為60%～80%。自單克隆抗體與流式細胞術聯合應用以來，流式細胞術已成為白血病免疫分型的重要手段。使用多參數單克隆抗體進行同時標記，可特異的、全面的檢測白細胞抗原的分布情況，使AL免疫分型的結果更為客觀準確[2]。本研究通過對91例AL形態學和免疫表型分型，并進行對比分析，探討細胞形態學和免疫表型特征的關系，以提高AL實驗室診斷水平。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2011年7月至2012年9月寧波市鄞州人民醫院血液科就診的AL患者共91例，其中男51例，女40例；年齡2～85歲，平均（49±24）歲；兒童19例，成人72例。

1.2 儀器與試劑瑞-姬氏染液自備。細胞化學染色試劑有細胞過氧化物酶（POX）染色、特異性酯酶（CE）染色、糖原染色（PAS）及醋酸萘酚酯酶染色（a-NAE）試劑盒均購自珠海貝索生物技術公司。異硫氰酸熒光素（FITC）、藻紅蛋白（PE）、多甲藻葉綠素蛋白（PerCP）和別藻青蛋白（APC）標記的單克隆抗體，及紅細胞裂解液（FACS Lysing Solution）、破膜固定液、8-colorsetup標準微球和流式細胞儀FACSCanto II均購自美國Becton Dickinson公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞形態學診斷采集骨髓標本，離體后立即制成骨髓涂片。涂片標本經瑞-姬氏染液染色后，油鏡下觀察并計數200個細胞，按FAB分型法進行分型，再進行POX、CE、PAS和a-NAE染色。

1.3.2 單克隆抗體標記采集骨髓標本1～2 ml，肝素抗凝。細胞膜抗原標記方法為每管加入1×106個細胞100 l，試管內加入10l所需不同標記單克隆抗體，以四色抗體組合為主。FITC標記抗體有CD15、HLA-DR、CD14、CD10、CD22、CD2、CD3和CD61；PE標記抗體有CD117、CD13、CD33、CD19、CD7、CD8和CD235a；APC標記抗體有CD34、CD11b、CD20、CD56、CD5和CD4。每管均加入PerCP-CD45，同型對照為不同熒光染料標記的IgG1。室溫避光孵育20 min后用500l紅細胞裂解液溶血10min，1200r/min離心5 min后棄上清，沉淀物以2 mlPBS洗滌1次，加0.5 mlPBS重懸。細胞內抗原標記方法為每管加入1×106個細胞100 l，試管內加入10l PerCP-CD45，混勻避光孵育20 min后加入500l紅細胞裂解液溶血10 min，1 200 r/min離心5 min后棄上清，再加入1∶10稀釋的破膜固定液500 l避光孵育10 min，2 ml PBS洗滌1次，加入抗體MPO-FITC/CD79a-PE/ CD3-APC各10 l，室溫避光孵育20 min后用500 l PBS重懸。設立不同熒光染料標記的IgG1同型對照。

1.3.3 流式細胞術檢測FACSCanto II型流式細胞儀進行檢測，用DIVA軟件分析。樣本進入流式細胞儀檢測前，以8-color setup標準熒光微球校正流式細胞儀光路系統。應用前向角散射（FSC）/側向角散射（SSC）設門去除碎片群的影響，再用CD45/SSC二維散點圖上設門區別幼稚細胞群和成熟細胞群，以同型對照去除自發熒光劑非特異性熒光的影響，分析各管中幼稚細胞群免疫表型。

2 結果

2.1 細胞形態學診斷按FAB分型診斷標準，91例AL患者中59例急性髓系白血病（AML）：1例M0、3例M1、20例M2、14例M3、11例M4和5例M5，未見M6和M7，不能分型有5例；32例急性淋巴細胞白血病（ALL）中29例能明確診斷，3例不能分型。

2.2 細胞免疫分型59例AML患者的CD13、CD33、CD15、CD11b和MPO陽性率分別為93.2%、76.2%、55.9%、15.2%和79.6%，非相關系列抗原CD34、HLA-DR和CD117陽性率分別為61%、62.7%和89.8%，表達淋系相關抗原CD7、CD4、CD2和CD5陽性率分別為15.2%、8.5%、3.45%和1.7%。32例ALL經免疫分型確診：8例T-ALL表達T系抗原CD2、CD3、CD5、CD7、CD4、CD8和cCD3陽性率分別為75%、50%、75%、100%、25%、37.5%和100%，非相關系列抗原CD34和HLA-DR陽性率分別為50%和62.5%；24例B-ALL表達B系相關抗原CD19、CD22、CD10、CD20和cCD79a陽性率分別為100%、70.8%、45.8%、33.3%和75%；CD34和HLA-DR陽性率分別為100%和62.5%。8例FAB不能分型的AL患者有5例AML、1例T-ALL和2例B-ALL。經免疫分型后5例AML確診為1例M1，3例M2和1例M3。1例ALL經免疫分型證實為T/ B混合型AL，1例證實為雙表型AL。免疫分型顯示4例M1中CD4+1例；23例M2患者中表達淋系抗原有6例CD7+，2例CD2+，1例CD56+和1例CD5+；11例M4中表達淋系抗原有3例CD4+，2例CD7+和1例CD2+；5例M5中淋系抗原有1例CD7+和1例CD4+。B-ALL中表達髓系抗原有5例CD15+，2例CD13+和2例CD33+；T-ALL中表達髓系抗原有2例CD117+，1例CD13+，1例CD33+。

3 討論

AL存在某些系列多樣性和異質性，單一依據細胞形態學及細胞化學染色診斷AL已顯得不足，用單克隆抗體分型白血病細胞表面的免疫標志，以進一步明確白血病細胞的起源及分化程度，為臨床診斷、治療及判斷預后提供重要依據[3]。

本研究對就診91例AL進行FAB和細胞免疫表型分型，兩分型診斷相符率為91.2%。8例FAB不能分型的AL經免疫表型分型后得到確診，為診斷和治療提供重要的實驗依據。研究表明，急性髓系白血病細胞表達髓系抗原CD13、CD33、CD117和MPO陽性率分別為93.2%、93.2%、89.8%和79.6%，表達淋系抗原CD7、CD4、CD2和CD5陽性率分別為15.2%、8.47%、5.08%和1.6%，與馬瑞霞等[4]報道結果相似，但本次研究中無CD19陽性表達。隨著AML發病機制研究的不斷進展，有研究表明免疫分型可以作為AML危險度分層的獨立因子，但具體結論尚有爭議[5]。CD38、CD34和HLA-DR是干/祖細胞表達免疫標記，表達隨細胞分化程度增高而減少，直至關閉，通過對以上幾種標記的檢測以判定是否為AL[6]。Repp等[5]對783例AML患者骨髓及外周血免疫表型分析，發現CD11b、CD13和CD34表達為預后不良因素，CD15、CD33和CD38為預后良好因子。同時，馬瑞霞等[4]報道CD7在AML各分型中均有表達，可能與預后不良有關。本研究中均有上述相關抗原的檢測。

T細胞早期階段腫瘤（T-ALL，T淋巴母細胞淋巴瘤）表達早期抗原CD34或HLA-DR和T細胞抗原。B細胞早期階段腫瘤表達早期抗原CD34或HLA-DR和B細胞抗原[7]。本研究中8例T-ALL患者CD34和HLA-DR陽性率分別為50%和62.5%，而24例B-ALL患者中CD34和HLA-DR陽性率分別為100%和62.5%，為AL細胞的分化程度提供有效數據，為臨床預后判斷提供有效數據。

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[3]汪永紅,黃知平,李滔,等.急性白血病免疫表型及伴髓系/淋系抗原表達的比較[J].實用醫學雜志,2010,26(17):3231-3233.

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10.3969/j.issn.1671-0800.2014.07.071

R733.7

A

1671-0800(2014)07-0907-02

315040寧波，寧波市鄞州人民醫院

李珊鳳，Email：lsf1984con@ qq.com