炔雌醇和菲2種環境內分泌干擾物對斑馬魚的影響研究進展

胡志偉，鐘愛華(浙江海洋學院水產學院，浙江舟山316022)

環境內分泌干擾物(Environmental endocrine disruptors，EEDs)是指一種會使未受損的有機體發生逆向健康影響或者有機體后代的內分泌功能發生改變的外源性物質。環境內分泌干擾物主要包括天然激素、人工合成的激素化合物和具有內分泌活性或抗內分泌活性的化合物［1］。炔雌醇(EE2)是一種常見的EDCs，是合成避孕藥的常用成分之一，通過污水處理系統進入水環境。在污水處理系統排出的水中，炔雌醇的濃度可達7.2～42.0 ng/L。約5.7%的美國河流中炔雌醇含量超過5 ng/L。由于炔雌醇的半衰期長及生物富集作用，魚體內炔雌醇的含量可比自然環境中高332倍，而且炔雌醇的雌激素作用在生物體內為雌二醇和雌激素酮的10～50倍。菲(C14H10，PHE)是一種多環芳烴，由3個苯環連接而成，化學結構特殊，具有“K區”(即9，10雙鍵)，菲是水環境中一種重要的有機污染物，在全國的各個水域，菲含量均偏高:中國大亞灣海域的次表層海水中菲的含量高達435 ng/L［2］，珠江的澳門水域的表層水中菲的含量為101.82 ng/L［3］，廈門的馬鑾灣海水養殖區的表層海水菲的含量為24.4 ng/L［4］。PHE屬于多環芳烴類物質，在水環境中作為性激素類似物，可對魚類與繁殖有關的形態、行為和生理功能產生重要影響。研究表明，PHE能夠在魚組織中富集，并誘導抗氧化酶的激活［5］。PHE可能通過誘導抗氧化酶，同時抑制芳香族化合物受體的正常活性，干擾芳香化酶系統從而擾亂性激素的代謝。

斑馬魚具有容易飼育、突變種多、遺傳學工具成熟等優點，已成為研究脊椎動物發育與人類遺傳疾病的新興模式生物;此外，斑馬魚的基因組中含有約30 000個基因，與人類差異不大，并且它的許多基因與人類的基因有一一對應的關系。美國環境保護署和經濟合作發展組織將斑馬魚列為研究內分泌干擾物對脊椎動物影響的模式生物之一。鑒于炔雌醇和菲在環境中的廣泛分布，2種環境內分泌干擾物可對魚類生長發育產生影響。筆者綜述了炔雌醇和菲2種環境內分泌干擾物對斑馬魚的影響及其機制的進展，為深入研究環境內分泌干擾物對魚類以及其他高等脊椎動物的生長發育影響提供一定的參考。

1 炔雌醇對斑馬魚的影響

1.1 對斑馬魚生長的影響 將孵化后20 d的斑馬魚暴露在炔雌醇下進行試驗，結果表明用17-α炔雌醇處理過的斑馬魚生長發育顯著減慢，體重和體長都明顯低于對照組，并且斑馬魚的平均體長與EE2暴露濃度呈負相關［6］。EE2處理組體重為(0.132 ±0.031)g，空白對照組為(0.175 ±0.034)g，與空白對照相比，EE2組體重極顯著下降(P＜0.01)。這表明EE2能顯著影響斑馬魚的體長和體重。

1.2 對斑馬魚性別比例的影響 EE2能影響斑馬魚生殖功能，主要是由于EE2干擾斑馬魚性腺的發育分化［7］。與Scholz和Gutzeit發現在100 ng/LEE2處理組中所有的雄性青魚都發生了性別逆轉［8］這一結果相似，斑馬魚在0.4 ng/L EE2處理組的性腺與對照組無明顯差異，然而2 ng/L EE2組大部分魚(16/20)的性腺為幼稚的卵巢樣組織，10 ng/LEE2暴露組雌魚的比率明顯高于對照組，且差異顯著。研究表明，斑馬魚暴露于含有EE2的水環境中，可以導致雄性斑馬魚雌性化，性別比例改變以及生殖功能受損［9－10］，主要是干擾了斑馬魚的性腺發育分化。將EE2處理組及對照組斑馬魚恢復至清水中后至180 dPh時，通過性腺組織切片檢查發現斑馬魚的性別比例恢復了正常，但是在處理組中能發現有明顯的生精小管畸形及精子數量減少，說明EE2暴露對斑馬魚性腺發育分化有一定的可逆性［11］。

1.3 對斑馬魚VTG蛋白含量的影響 卵黃生成素(Vitellogenin，VTG)在動物性成熟過程中起著重要的作用，是由雌激素和類雌激素誘導在肝細胞表達的大分子蛋白質，為脂蛋白——卵黃蛋白的前體，是發育早期就存在的一個敏感的雌激素污染生物標志物。VTG是特異地存在于非哺乳類性成熟的卵生雌性動物血液中的一種蛋白，內源或外源性雌激素能刺激卵生動物的肝細胞產生VTG，通過血液循環運輸到卵巢，作為卵黃蛋白的營養支持。幼魚和雄魚在正常情況下不合成VTG，但在受到雌激素和類雌激素刺激時能合成VTG，導致魚體中VTG濃度升高，雌性化個體增加，測定其血清或整體的VTG含量，可反映環境中某些類雌激素物質的存在及其效應，VTG已經成為水體中EEs污染的重要生物標志物［12］。將斑馬魚暴露在EE2，檢測卵黃蛋白原VTG蛋白含量的變化，標記綠色熒光技術發現在21 dph時在10 ng/L處理組中首次發現VTG的mRNA;28 dph以后，其表達水平進一步升高，在28 dph時肝臟熒光亮度和熒光區域均有所增加［11］，熒光增加表示mRNA合成增加，對照組斑馬魚的肝臟中均未看到明顯熒光，表明EE2能促使VTG合成。

1.4 對斑馬魚的其他影響 在EE2暴露過程中觀察到隨著的時間推移死亡率逐漸增加，90 dph時暴露在濃度為2和10 ng/L EE2中的斑馬魚死亡率均超過了60%，且將斑馬魚暴露于100 ng/L的EE2下至60 dPh可導致死亡率明顯增高［13］。在暴露40 dph后，部分斑馬魚出現了心包水腫，心包水腫發生率與暴露濃度呈線性相關［11］。隨著暴露時間的延長，斑馬魚的死亡率和心包水腫的發生率都增大了，心包水腫是一種常見的非特異毒性的指標，因此2～10 ng/L EE2的暴露已經具有一定的非特異毒性作用。由于心包水腫情況嚴重，同等體長的情況下增加了體重，可通過體重和體長的對比性作為EE2暴露的指標之一。

2 菲對斑馬魚的影響

2.1 對斑馬魚鰓和肝組織的影響 經菲溶液暴露后，斑馬魚的鰓組織均受到損傷，鰓小片上皮細胞發生肥大和水腫，并且濃度越高，發生鰓絲上皮增厚、鰓小片上皮細胞水腫程度增加，部分鰓小片上皮表現明顯隆起、少數鰓小片上皮細胞發生壞死與脫落，魚的鰓組織受到的損傷加重。將菲作為水環境中的主要變化因子，當魚被暴露在低濃度的菲溶液中時，斑馬魚的鰓小片發生了肥大和水腫，屬于防御反應;當菲溶液濃度較大時，魚的鰓小片上皮發生明顯隆起，且少數鰓上皮細胞出現壞死和脫落等現象，已經對魚體產生嚴重的直接損傷。當斑馬魚被暴露在菲溶液中時，部分肝細胞發生了腫大，細胞質中出現空泡，少數細胞核變形，而當菲溶液濃度升高時，魚的肝細胞損傷程度增大除了發生腫大外，還表現為細胞形狀變得不規則，細胞核發生嚴重萎縮變形及偏離細胞中心，胞質中空泡化程度加重，部分肝細胞的核溶解或細胞溶解造成肝組織發生局部壞死。在菲溶液中暴露后的斑馬魚，其體質量偏低，說明鰓的氣體和物質交換受阻，營養不足，再加上肝臟損害，影響了機體的新陳代謝［14］。

2.2 對斑馬魚繁殖行為的影響 PHE屬于多環芳烴類物質，在水環境中作為性激素類似物，可對魚類與繁殖有關的形態、行為和生理功能產生重要影響。魚類繁殖行為的確定方法一般在觀察的30 min內，根據雌、雄魚相互追逐、繞圈游動和雄魚用吻部碰觸雌魚腹部3種典型繁殖行為出現的頻率，給斑馬魚繁殖行為的明顯性賦值即繁殖行為指數［15］。對性別分化已完成的斑馬魚進行短期PHE暴露，記錄在PHE短期暴露下各試驗組的斑馬魚繁殖行為指數，用于反映PHE對斑馬魚繁殖行為的影響，發現斑馬魚繁殖行為受到了明顯的抑制，結果表明在低濃度的試驗組和對照組斑馬魚的繁殖行為無顯著差異，仍有明顯的繁殖行為，如雌雄魚激烈地相互追逐，繞圈游動現象較頻繁，多次觀察到雄魚用吻部碰觸雌魚腹部的協助排卵行為;在PHE質量濃度較高的試驗組中，繁殖行為顯著減少，斑馬魚興奮性差，大多數都是平靜地游動，很少有相互追逐的現象，幾乎沒有2條魚之間相互接觸的現象。

2.3 對斑馬魚產卵量、受精率、孵化率和仔魚死亡率的影響 將性成熟的斑馬魚分別暴露在PHE質量濃度為0、0.05、0.50、5.00 和50.00 μg/L 的水中7 d 后，將其配對進行繁殖，配對24 h后統計產卵量、受精率，受精卵3 d內的孵化率以及仔魚7 d內的死亡率。結果表明，隨著PHE的逐漸升高，斑馬魚的產卵量逐漸下降，即PHE對斑馬魚的產卵量有顯著的抑制作用。對照組與低濃度組在產卵量上沒有較大差異，而高濃度的抑制作用則很明顯，與對照組差異較大。統計7 d后各組斑馬魚所產卵的平均受精率，暴露在低質量濃度PHE中的斑馬魚的受精率與對照組無明顯差異，在受精率的數值上甚至比對照組略高。PHE質量濃度分別為0.50、5.00 和50.00 μg/L 的試驗組與對照組相比有顯著差異，且隨著PHE質量濃度的升高，抑制作用呈現增強的趨勢。當PHE小于5 μg/L時，PHE對斑馬魚的孵化肯有一定的促進作用，且孵化率高于空白對照組，但是促進作用會隨著質量濃度的升高而減弱;當PHE的質量濃度達到50 μg/L時，PHE對斑馬魚的孵化呈現抑制作用。對于7 d內斑馬魚仔魚的死亡率無顯著的相關性。在低質量濃度0.05 μg/L的PHE中，斑馬魚的產卵行為受到了微弱的抑制作用，卻對卵受精具有微弱的促進作用，但是二者的作用都不顯著，并且在暴露在PHE的這段時間中斑馬魚的繁殖行為還沒有受到影響。較低濃度PHE(≤5 μg/L)處理下，卵的孵化受到了促進作用，但這種促進作用會隨著PHE濃度的升高而下降。綜上所述，高PHE(≥0.5 μg/L)對斑馬魚的繁殖行為、產卵量和受精率，都產生較為顯著的抑制作用。而低濃度PHE(≤0.05 μg/L)對斑馬魚的繁殖行為、產卵量和受精率的影響較為微弱。暴露在低質量濃度的PHE可促進斑馬魚卵的孵化，但這種作用會隨著濃度的升高而逐漸減弱，高濃度則反而會抑制斑馬魚卵的孵化［16］。

3 展望

在我國，EDCs污染研究控制中還有許多問題，如研究不足，情況不明;來源不明，總量增加;政策缺乏，難于控制。許多城市飲用水中均含有HCHs和DDTs，即使空氣中EDCs的濃度水平較低但仍不能忽視。有關雌二醇、壬基酚、雙酚A等內分泌干擾物質對斑馬魚繁殖行為的影響，Brion［17］研究發現斑馬魚暴露于雌二醇中，其繁殖行為包括產卵量、孵化率等將受到一定影響。沈萬赟等研究發現壬基酚和雙酚A分別作用下對斑馬魚的繁殖行為產生抑制作用，二者協同使用甚至可能終止斑馬魚的繁殖行為［18－19］。內分泌干擾物可通過作用于下丘腦－腦垂體－性腺軸的內分泌系統途徑，影響重要激素或者受體，并最終影響動物的繁殖;也可作用于下丘腦－腦垂體－甲狀腺軸途徑，影響甲狀腺激素的合成、轉運和結合等過程，破壞甲狀腺激素內環境的穩定而對生長發育造成危害［20］。美國環保署己經將內分泌干擾物列為高度優先研究和控制的污染物，并于1999年開始實施內分泌干擾物篩選行動計劃，組織篩選環境中具有雌激素活性或能阻斷雌激素活性的化學物質［21－22］，英國環保部將內分泌干擾類物質的生產和排放加以控制，如禁止壬基酚、聚氧乙烯醚類表面活性劑的使用等，于2000年實施內分泌干擾物的研究行動計劃。我國對環境內分泌干擾物的研究正處于起步階段。面對環境內分泌干擾物的毒理學和污染，我國現在還缺乏系統的環境內分干擾物的研究。筆者綜述了決雌醇和菲對斑馬魚的影響，可為我國的環境內分泌干擾物研究提供－些資料。

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