植物組織培養在育種中的應用

祝劍峰(湖北生態工程職業技術學院，湖北武漢430200)

植物組織培養技術具有培養材料經濟、培養條件可以人工控制、生產周期短和繁殖效率高等特點，廣泛應用于農業生產，并對傳統的植物育種方式產生了革新。目前國內外已將植物組織培養普遍應用于作物育種研究，并在單倍體育種、多倍體育種、遠緣雜交育種、突變育種、轉基因育種以及種質資源離體保存等方面取得了較大進展。筆者分別從單位體育種、多倍體育種、遠緣雜交育種、人工種子、篩選突變體、轉基因育種和種質資源保存等方面對植物組織培養在育種中的應用進行了綜述。

1 單倍體育種

單倍體育種是植物育種手段之一，是常規純和育種手段的革新。即利用植物組織培養技術對植物的生殖細胞進行離體培養誘導產生單倍體植株，再通過某種手段使染色體組加倍(常用秋水仙素處理)，從而獲得純和的二倍體植株。常規的純和育種一般需要經過8～10個世代選育，而通過單倍體育種只需要一個世代基因即可達到純和，大大縮短了育種周期［1］。

在自然界單倍體一般是通過孤雌生殖的方式產生，出現的頻率極低，只有十萬分之一，并沒有得到廣泛利用。隨著單倍體在植物遺傳育種領域中的重要性逐漸為人們所認知，世界各國紛紛開始了單倍體育種研究。目前，單倍體植株的獲得主要是對花粉或花藥和未受精的子房和胚珠進行離體培養。

1.1 花藥和花粉培養 花藥是植物雄性生殖器官，由2種不同倍性的細胞組成，藥壁和藥隔組織為二倍體細胞，雄性生殖細胞(花粉粒)為單倍體細胞?；ㄋ幒突ǚ叟囵B是改變花粉原來的發育途徑，誘導花粉分裂增殖，形成愈傷組織，經過再分化，發育成單倍體植株［2］。

自1964年Guha和Maheshwari首次用曼陀羅的花藥進行培養獲得單倍體植株以來，世界各國都相繼進行了花藥單倍體育種研究。我國的花藥培養育種研究始于1972年，在世界上處于領先地位。1974年，我國利用單倍體培育出世界上第一個作物新品種——煙草單育1號［1］。近年來，花藥培養的研究十分活躍，進展也很顯著。已培育出煙草、水稻、小麥、玉米和辣椒等20多個新品種，如煙草“單育1號”、水稻“單豐1號”、水稻“中花9號”和小麥“花培1號”等［3］。我國科學家朱至清設計的花藥培養基N6和改良N6培養基，在國內外被廣泛應用。

花藥與花粉培養已與常規雜交育種、遠緣雜交育種、誘變育種以及轉基因育種技術相結合，發展形成了一套育種技術體系。由于花藥和花粉培養的方法日趨完善，花藥培養育種已成為生物技術在農作物育種中應用最廣泛、最有成效的方法之一，逐漸成為作物改良和新品種培育工作的一個重要手段。

1.2 子房與胚珠培養 胚珠是種子植物的大孢子囊，是雌配子孕育的場所，直接使用子房或者從胚囊中分離出未受精的胚珠，在人工控制的條件下進行離體培養，誘導大孢子或卵細胞增殖，形成單倍體植株，與花粉單倍體植株相同，可用于單倍體育種。

雖然花粉(花藥)培養是獲得單倍體植株的主要途徑，并廣泛應用于生產，但對于花藥培養誘導率過低和雄性不育的植物，要想獲得單倍體植株，子房與胚珠培養是唯一可行的途徑。此外，花粉植株的性狀變異率較胚珠培養獲得的單倍體植株高，在禾本科植物中，花粉植株試管苗玻璃化率較高，而子房和胚珠培養獲得的單倍體植株試管苗玻璃化幾率較低［4］。

2 多倍體培育

多倍體在自然界廣泛存在，較之二倍體植株，普遍具有植株巨型化、抗逆性增強、營養成分含量增加等優勢，被廣泛應用于育種研究中。被子植物的胚乳是雙受精的產物，屬于三倍體，通過被子植物的胚乳離體培養可以獲得三倍體植株，三倍體品種具有產量高、觀賞性提升及不結實等優勢而備受育種工作者的關注。而將三倍體植株通過染色體加倍，可以獲得六倍體植株，以解決三倍體不結實的問題，并用于培育多倍體新品種。常規的三倍體是采用2n×4n有性雜交獲得，但此方法選育時間長，雜交難度大，而采用胚乳作為外植體進行組織培養獲得再生植株，可以有效地解決這一難題。胚乳培養研究始于20世紀30年代，并首次在蘋果上獲得了三倍體，隨后相繼在馬鈴薯、水稻、小麥、蘋果、棗、柑橘、梨、獼猴桃等植物中獲得胚乳植株。目前已有40余種植物的胚乳培養取得突破，有近20種植物成功獲得了胚乳再生植株［5］。

3 培育遠緣雜交品種

3.1 試管受精 在遠緣雜交中，由于親本親緣關系較遠，易發生生殖隔離的障礙，出現花粉與柱頭不親和，花粉在柱頭上不能萌發，花粉管生長受抑而不能進入胚珠，花粉管在花柱中破裂等現象［6］，使受精過程不能正常進行，導致不能形成合子，這些均屬于受精前生殖隔離障礙。對于上述發生在受精前的生殖隔離障礙，可以采用離體授粉技術予以克服，即通過離體培養使花粉與柱頭親和，或者使花粉不經過柱頭直接與胚珠接觸。離體授粉是將未受精的子房或胚珠進行離體培養，然后授以無菌的花粉，使之在試管內完成受精的技術，又稱為離體受精或試管受精。試管受精技術研究始于20世紀60年代初，Dulieu等分別在煙草和金魚草、玉米上通過離體柱頭授粉獲得成功;Inomata等進行了有性雜交不親和的油菜與甘藍的離體子房受精研究，成功獲得了種間雜種植株。葉樹茂等在小麥中獲得成功，得到了普通小麥×黑麥草和節節小麥×普通小麥的雜種植株。

3.2 胚挽救 在遠緣雜交中，雖然受精成功并形成了合子，但由于胚乳發育不正?；蛘唠s種胚和胚乳之間生理上的不協調，易導致雜種胚在發育過程中夭折，這屬于受精后的生殖隔離障礙。通過將遠緣雜交獲得的雜種幼胚進行離體培養，可以克服遠緣雜交受精后的生殖隔離障礙，成功獲得遠緣雜種植株，這種應用在遠緣雜交中的幼胚離體培養技術稱為胚挽救，又稱為胚拯救。將胚挽救與試管受精技術相結合，大大提高了遠緣雜交的成功率。目前，已通過該方法獲得了很多種間、甚至屬間的雜種植株，擴大了雜種優勢的利用范圍。

3.3 原生質體培養與體細胞雜交 原生質體是指植物細胞經質壁分離后，除去細胞壁的裸露細胞組織，與完整的單細胞相比，除沒有細胞壁外，其他功能與活細胞相同，并具有植物細胞的全能性。1892年Klercker最早利用機械切割的方法分離得到原生質體，1960年英國植物生理學家Cocking首次利用纖維素酶從番茄根細胞分離得到原生質體［7］。原生質體經過分離、純化后，進行離體培養，可以再生細胞壁，然后通過愈傷組織或胚狀體途徑，發育成完整植株。

原生質體最大的研究價值在于這些除去細胞壁的裸細胞沒有細胞壁的束縛，無論親緣關系如何，都具有彼此融合的能力。采用物理或者化學的方法誘導，使不同物種之間由體細胞獲得的原生質體發生融合，經組織培養體系再生成完整植株，稱為體細胞雜交。通過體細胞雜交，不需要進行受精過程即可獲得雜種植株，因此可以有效克服遠緣雜交的不親和性，培育出更多的新品種和創造新的物種。目前已經獲得40余個種間、屬間和科間的體細胞雜種植株。

4 體細胞胚胎發生與人工種子

體細胞胚胎發生是指植物的體細胞經特定條件誘導，未經精卵融合，而形成與合子胚類似的結構，并通過與合子胚胎類似的發育途徑形成植株的過程。這種與合子胚類似的結構稱為體細胞胚胎或胚狀體。自Reinert和Steward等于1985年從胡蘿卜根培養中獲得體細胞胚胎起，國內外不少學者開始從事該研究，體細胞胚胎發生已經被公認為是植物界的普遍現象，是離體培養植株再生的一個基本發育途徑，并使人工種子的制作成為可能。

人工種子又稱為合成種子或無性種子，是將通過體細胞胚胎發生產生的胚狀體包裹在有養分和具有保護功能的介質中形成類似于植物天然種子的結構，由體細胞胚、人工胚乳和人工種皮3部分構成。人工種子不僅能像天然種子一樣可以播種和發育成植株，而且還具有許多優點:①不受季節和環境的影響，繁殖快，有利于工廠化生產;②在制作人工種子時加入生長調節物質和抗生素等可以人為地賦予種子各種優良品質;③人工種子在本質上屬于無性繁殖，可以固定雜種優勢;④人工種子體積小，無內源菌，不易霉變，便于保存與運輸［2］。

5 篩選突變體

在植物組織培養過程中會出現各種變異，其中通過愈傷組織途徑獲得的再生植株出現突變的頻率較不定芽途徑高，細胞培養獲得的再生植株出現的突變頻率較器官和組織培養的突變頻率高。原因在于愈傷組織和懸浮培養的細胞，處于旺盛的分裂狀態，加之缺乏有組織的結構，易受培養條件和誘變因素的影響而產生變異。從中可以篩選出對人類有用的突變體，從而育成新品種。對于誘發突變較為困難、突變率較低的一些性狀，在細胞培養時期進行誘發和篩選，由于細胞數目十分巨大，因此一些突變率極低的性狀也可以從中選擇出來，為進一步選育提供了豐富的變異類型。目前，在組織培養過程中已篩選出抗病蟲害、耐鹽、耐旱、高賴氨酸、高蛋白的突變體，有些已應用于生產。

6 轉基因育種

植物轉基因技術是把從動植物或微生物中分離獲得的目的基因片段，通過各種方法整合到植物基因組中，使之穩定遺傳，并賦予植物抗病、抗蟲、抗逆、高產、優質等新的性狀。目前，植物基因轉化方法主要是通過農桿菌介導和基因槍法［8］，使用的轉化受體均為離體培養的植物細胞，經轉化后的植物細胞，需要借助植物組織培養試驗體系進行植株再生。因此，植物組織培養技術為轉基因植物提供了重要的技術平臺，建立高效穩定的組織培養再生體系是轉基因育種的重要前提。研究認為用于基因轉化的受體系統，應具有80%以上的再生頻率［1］。

自1983年獲得第一株轉基因植物以來，目前已有100余種植物成功獲得轉基因植株。利用植物遺傳轉化技術創建的很多品種，如玉米、大豆油菜、馬鈴薯等已推廣利用，并產生了巨大的經濟效益和社會效益。

7 種質資源離體保存

種質資源是植物育種的基礎，自然災害和人類活動造成相當數量的植物物種正逐年消失，搜集和保存種質資源已受到世界各國的重視。但常規的種質資源保存方法是采用原生境保存，需要建立植物園或種質圃，不僅需要耗費大量的人力、物力和土地，且易遭受災害和病蟲害的侵襲，造成種質資源流失。1975年，Henshaw和Morel首次提出了離體保存的方法［9］。種質資源離體保存是將離體培養的小植株、器官、組織、細胞或原生質體等材料，采用限制、延緩或者停止其生長的方法使之保存，在需要時可重新恢復其生長，并再生植株的方法。種質資源離體保存有以下優點:所占空間少，節省大量的人力和財力;便于種質資源的交流與利用;需要時，可以用離體培養方法很快大量繁殖;避免自然災害引起的種質丟失。目前，已有許多種植物在離體條件下，通過抑制生長的方法，使組織培養物能長期保存，并保持其生活力。但種質資源離體保存時需要定期進行繼代培養，多次繼代培養可能造成遺傳性變異及培養物的分化和再生能力的逐漸降低，研究人員建立了離體種質資源冷凍保存技術，有效地降低了繼代周期，隨著種質資源離體保存技術的不斷發展和完善，使將來建立離體種質資源庫成為可能。

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［8］張東旭.大豆胚尖再生體系的建立及E－2基因遺傳轉化［D］.石家莊:河北農業大學，2008.

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