植酸鈦納米材料固定酶制備過氧化氫傳感器

潘羽俠,董 潔,葉平平,李夢珠,諸瑩婕,向 媛,楊海峰

(上海師范大學 生命與環境科學學院,上海 200234)

0 引 言

近年來,具有層狀結構的磷酸鹽已被人們廣泛研究.其制備方法一般主要有溶膠凝膠法[1]、水熱合成法[2]、溶劑熱合成法[3]等.微波合成法是最近迅速發展起來的一種綠色、快速、高效的材料合成新技術[4],自20世紀70年代中期,Hesek等[5]將微波技術應用于分析化學中開始,微波合成法以其獨特的加熱方式受到科研人員的密切關注,并進行了大量的相關研究工作.

目前,微波合成法已被廣泛用于磷酸鋁分子篩和硅酸鋁沸石的合成中[6-8].傳統的加熱方式是靠輻射、對流、傳導等3種方式由表及里加熱,而微波加熱不同于此,其具有其他合成方法不可比擬的優點:受熱均勻,加熱速度快,結晶迅速[7],粒徑小且均勻[9-11],副反應少,產物相對單純[12]等.最近,有報道指出,由于微波合成法結晶迅速,應用此方法可以使合成的產物孔徑增大[13].因此,微波合成法是一種有效合成材料的方法.

植酸為環境友好型的分子[14],植酸 (IP6或PA)是一類天然物質,在許多植物組織,特別是在麩類和種子中,作為磷的主要存在形式.它具備一些獨特的優點,如生物相容性好,無毒和對環境友好.符合當今的科研時代趨勢.每個植酸分子可提供6對氫原子使自由基的電子形成穩定結構,通過研究小組前期的工作已經了解到[15-16],將一定濃度的植酸鈉加熱,可形成植酸膠束,用于納米粒子的穩定劑和表面活性劑,有效地保護了納米粒子.

辣根過氧化物酶 (Horseradish Peroxidase,HRP)是一種性質穩定,活性高、商品化較早的生物分子.它可以作為一種生物合成和轉化的試劑,被廣泛應用在生物傳感器、廢水處理、環境化學等領域,是研究最多的一種過氧化物酶.過氧化物酶在生物體內以及食物藥物中有著重要影響,生物體內許多過氧化物酶參與的酶促反應的副產物是過氧化氫 (H2O2),因此通過檢測過氧化氫的含量來研究過氧化物酶的動力學和熱力學性質,為了解生物體內的生命現象提供了可能.在檢測的眾多方法中,電化學生物傳感器方法可以實現對H2O2的快速、高效的檢測,因此,過氧化物酶電化學傳感器在H2O2的檢測中發揮著重要作用.同時,隨著酶固定化技術的發展和新檢測方法的應用,辣根過氧化物酶傳感器的檢測性能不斷提高,應用領域也不斷拓展.

本研究嘗試利用微波合成法快速合成納米植酸鈦材料,并通過FESEM表征發現它具有多孔結構.進而,運用這種材料結合混合滴涂的方法將HRP成功修飾到電極表面制備了一種過氧化氫傳感器.紫外可見光譜和電化學實驗結果證明了這種材料良好的生物相容性,該法制備的生物傳感器表現出良好的電化學性能.

1 實驗部分

1.1 實驗試劑

硫酸鈦 (分析純,國藥集團化學試劑有限公司)；植酸鈉 (IP6,分析純,Aldrich公司)；辣根過氧化物酶 (HRP,EC 1.11.1.7,RZ>3.0,A>250 U·mg-1,上海麗珠東風生物科技有限公司)；磷酸鹽緩沖溶液 (PBS,67 mmol·L-1)由KH2PO4和Na2HPO4調配而成,不同pH的緩沖溶液用0.1 mol·L-1的NaOH與H3PO4調節得到；所有實驗用水均為超純水 (18.2 MΩ·cm).

1.2 儀 器

CHI660D型電化學工作站 (上海辰華儀器有限公司),電化學實驗采用常規三電極體系:修飾電極 (自制)為工作電極,鉑電極作輔助電極,飽和甘汞電極作參比電極；760CRT型紫外可見分光光度計 (上海精密科學儀器有限公司)；場發射掃描電子顯微鏡 (FESEM)圖由Hitachi S-4800型掃描電鏡得；FE20型pH計 (上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；SK2200H型超聲清洗器 (上海科導超聲儀器有限公司).

1.3 實驗方法

1.3.1 植酸鈦納米粒子的制備

將植酸鈉 (IP6)溶液加熱至沸騰,然后將硫酸鈦酸性溶液 (植酸鈉和硫酸鈦溶液的摩爾比為1∶3)加入上述溶液中,混合均勻后轉移到微波反應器中,在100℃條件下反應40 min.冷卻后離心(7000 r/min),用超純水清洗后再分散,即得到納米植酸鈦分散液.

1.3.2 修飾電極的制備

玻碳電極經砂紙打磨,超純水超聲清洗后,用0.3 μm的α-Al2O3粉末在麂皮上拋光,然后分別用超純水、乙醇、超純水超聲清洗,用N2吹干.

首先取相同體積的植酸鈦分散液和5 mg·mL-1的HRP (pH=5.5),離心管中混合均勻,然后移取3 μL混合溶液滴在處理干凈的玻碳電極表面,置于冰箱中4℃下晾干,后用蒸餾水洗凈,晾干,就得到了辣根過氧化物酶-植酸鈦修飾的玻碳電極,將其置于4℃冰箱中儲存備用.修飾電極記作HRP/Ti-IP6/GCE.另外,按相同的方法制備修飾電極Ti-IP6/GCE做對比.

1.3.3 電化學測量方法

連接三電極系統,鉑電極為輔助電極,飽和的甘汞電極為參比電極,修飾電極為工作電極.向一定量的PBS (pH=7.0)溶液中通高純氮氣一定時間,以消除溶液中氧氣的干擾.循環伏安實驗在靜止溶液中操作,而計時電流實驗應在持續穩定攪拌的溶液中進行,待基線電流穩定后,加入一定量的H2O2,記錄電流響應值.

2 結果與討論

2.1 場發射掃描電子顯微鏡 (FESEM)表征

圖1 (A)是植酸鈦納米粒子的FESEM圖,(B)是植酸鈦與HRP等體積混合后的FESEM圖.通過FESEM比較可以看出,制備所得的植酸鈦納米粒子是形貌不規則且具有孔狀結構的,當植酸鈦與HRP混合后,發現形貌發生了改變,HRP在植酸鈦表面上形成了一層薄膜,說明HRP很好地修飾到植酸鈦上,這種結構也有助于實現直接的電子轉移.

圖1 Ti-IP6 (A)和HRP/Ti-IP6 (B)的FESEM圖

2.2 紫外可見光譜 (UV-vis)表征

圖2分別考察了植酸鈦分散液、HRP以及它們的混合物的紫外可見吸收曲線.曲線 (a)是植酸鈦分散液的紫外可見吸收曲線,可以看出它在300～800 nm波長范圍內沒有明顯的吸收峰.曲線 (b)是HRP溶液的紫外可見吸收曲線,397 nm處的吸收峰歸屬于HRP中三價鐵的Soret吸收帶,而植酸鈦與HRP混合溶液 (c)的紫外可見吸收曲線中,這個峰位于396 nm處,這與HRP的吸收曲線相比,只有1 nm的位移.同時,在這兩條吸收曲線中,500 nm和640 nm處歸屬于HRP的Q和CT吸收帶都存在,且峰形和峰位置完全沒有改變.以上表明修飾的HRP仍然保持其原有的生物活性,也證明了植酸鈦納米材料具有一定的生物親和性.

圖2 Ti-IP6(a)，HRP(b)和HRP/Ti-IP6(c)的紫外可見光譜圖

2.3 HRP在修飾電極上的直接電化學

圖3是裸玻碳電極和不同修飾電極在PBS (pH=7.0)中的循環伏安曲線,從圖3中可以看出,裸玻碳電極 (a)和修飾電極Ti-IP6/GCE (b)在PBS (pH=7.0)溶液中均沒有觀察到明顯的氧化還原峰,說明植酸鈦是一種非電活性的材料.而在修飾電極HRP-Ti-IP6/GCE (c)的CV曲線上有一對明顯的氧化還原峰,這對氧化還原峰同樣來源于HRP的血紅素中FeⅢ/Ⅱ的氧化還原反應,說明HRP已成功地固定到玻碳電極表面且保持了生物電活性,同樣證明植酸鈦納米粒子為HRP提供了一個良好的生物親和界面,實現了HRP與玻碳電極間的直接電子轉移.另外,當掃速為300 mV·s-1時,修飾電極的陽極峰電位Epa=-0.331 V,陰極峰電位Epc=-0.402 V,△Ep=71 mV,式量電位E0′=-0.367 V,說明該電極反應是一個準可逆反應過程.

圖3 修飾電極裸GCE(a),Ti-IP6/GCE (b)和HRP-Ti-IP6/GCE(c)在PBS (pH=7.0)中的循環伏安曲線(掃速:300 mV·s-1)

2.4 修飾電極不同掃速的循環伏安曲線

圖4研究了修飾電極HRP-Ti-IP6/GCE在PBS (pH=7.0)溶液中不同掃速下的循環伏安行為,以及峰電流與掃速之間的關系.由圖4中發現,隨著掃描速度的增加,修飾電極的氧化還原峰電流也在不斷地增加,且當掃描速度在100～500 mVs-1范圍內變化時,修飾電極的氧化還原峰電流與掃速成線性關系 (見圖4插圖),說明在該掃描速率范圍內電極反應是一個表面控制的電極反應過程,并進一步證明了HRP成功固定到電極表面,保持了良好的生物活性.

圖4 HRP-Ti-IP6/GCE在PBS (pH=7.0)溶液中不同掃速:100,200,300,400,500 mV·s-1下的循環伏安曲線(插圖:峰電流與掃速的線性關系)

2.5 溶液pH對修飾電極的影響

利用循環伏安法研究了修飾電極的式量電位E0′與溶液pH值之間的關系,以此考察修飾電極的循環伏安行為受外部溶液pH值的影響.圖5是修飾電極HRP-Ti-IP6/GCE在不同pH的PBS溶液中的循環伏安曲線.由圖5可見,當PBS溶液的pH值在4～9之間改變時,循環伏安曲線的氧化還原峰電位隨緩沖溶液pH值的增加而負移,并且修飾電極的式量電位E0′與溶液的pH值呈線性關系,斜率為-53 mV·pH-1(見圖5插圖).這一斜率值接近于伴隨一個質子轉移的單電子的可逆電極反應的理論值-59 mV·pH-1[17].

2.6 修飾電極對過氧化氫的電催化還原

圖6是修飾電極HRP-Ti-IP6/GCE對H2O2的電催化還原行為的研究.當在PBS中加入H2O2后,

圖5 不同pH值的PBS溶液中修飾電極的循環伏安曲線(插圖:式量電位與pH的關系.掃速:200 mV·s-1)

修飾電極的CV曲線峰形發生了很大的改變,與未加H2O2的CV曲線 (a)相比,隨著加入H2O2濃度增大,催化曲線的還原峰電流增大,氧化峰電流減小甚至消失.由此可見,修飾電極HRP-Ti-IP6/GCE對H2O2有良好的電催化還原作用,同時也進一步證明植酸鈦納米粒子保持了HRP的電催化活性.

圖6 修飾電極在不含(a)及含不同濃度的H2O2(b～d)在PBS溶液 (pH 7.0)中的循環伏安曲線(掃速:200 mV·s-1)

2.7 計時電流響應

圖7 HRP-Ti-IP6/GCE在PBS (pH=7.0)中連續加入H2O2的計時電流響應曲線(工作電位:-240 mV;插圖:響應電流與H2O2濃度的標準曲線)

2.8 穩定性和重現性

通過循環伏安法對修飾電極HRP-Ti-IP6/GCE的穩定性進行了考察.在PBS (pH=7.0)中以200 mV·s-1進行連續100圈的循環伏安掃描,其電流響應沒有明顯變化.將修飾電極置于PBS (pH=7.0)中4 ℃條件下保存40 d后進行CV掃描,其響應電流為初始電流的91%,表明制備的傳感器有良好的穩定性.

利用計時電流法考察了修飾電極的重現性.結果顯示:該修飾電極對1 μmol·L-1H2O2溶液重復5次測定的相對標準偏差 (R.S.D.)是2.85%.3支相同方法制備的修飾電極,在同一條件下對1 μmol·L-1H2O2的電流響應的R.S.D.為3.0 %,說明該傳感器有良好的重現性.

3 結 論

利用植酸鹽分子中磷酸基團與部分金屬離子的強絡合能力,通過微波合成法合成了新穎的植酸鈦納米材料,并運用這種材料結合混合滴涂的方法將HRP成功修飾到固定到玻碳電極表面.紫外可見光譜和電化學實驗結果證明了這種材料良好的生物相容性,有利于防止酶在固定化過程中生物活性的損害.此法制備的生物傳感器實現了HRP和玻碳電極之間的直接電子轉移,且對過氧化氫呈現出良好的電催化還原作用,同時具有良好的穩定性和重現性.

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