污泥深度脫水對四環素耐藥菌和耐藥基因的去除特性

譚國贛,杜勇立,黃滿紅,張 微

(1.中建五局土木工程有限公司,長沙 410004； 2.湖南省交通規劃勘察設計院,長沙 410008；3.東華大學 環境科學與工程學院,上海 201620)

0 引 言

污水處理廠污泥是污水處理的產物,每1×104m3污水經處理后約產生污泥(按含水率80%計)5～10×104kg[1].污泥中可能含有大量的重金屬物質、病原菌、病毒微生物和大量的毒性有機物,如不加以妥善處理和處置,將造成堆放和排放區周圍環境嚴重的二次污染,污泥的處置已成為一個全球性的環境問題[2-4].

抗生素是廣泛使用的殺菌藥物,經人類和動物使用后部分進入污水處理系統中,微生物在持續抗生素選擇壓力下產生了耐藥性形成耐藥菌,以及可能通過質粒和整合子等廣泛傳播,使得污水處理系統成為抗生素耐藥菌和耐藥基因的儲庫[5-6],而污泥中含有非常高的微生物量和豐富的營養,污泥是發生耐藥基因水平轉移的高發區,含有耐藥菌和耐藥基因的污泥的使用和填埋,會增加病原微生物感染人群的風險[7-8].盡管目前對污泥脫水減容技術有較多的研究[9-11],但是還沒有對污泥深度脫水中耐藥菌和耐藥基因的去除特性進行研究的報道.

四環素具有廣譜抗菌性、毒副作用小、成本低廉等優點,是廣泛使用的藥物.其在生物體內代謝程度很低,未經代謝后的殘留物可在環境中停留很長時間,因此在四環素的持續壓力下,研究者相繼在污水、飲用水和河水中檢測出四環素耐藥菌和四環素耐藥基因[12-15].本研究采用傳統平板法對四環素耐藥菌進行測定,采用RT-PCR對污水廠中四環素類耐藥基因數量進行測定,對污泥深度脫水中4種四環素耐藥基因的去除特性進行分析,以期為污泥中四環素類耐藥菌和四環素耐藥基因的控制提供參考.

1 實驗材料與方法

1.1 樣品的采集

為分析四環素類耐藥菌和耐藥基因的去除情況,本實驗對中國南方某大型城市的市政污水處理污泥進行采樣測定,其中原生污泥(即深度處理前污泥)取自某污泥深度處理設施的進料斗,深度脫水后污泥取自該設施配套的大型污泥填埋場.

污泥深度脫水工藝為:原生污泥首先與濃縮污泥(或者自來水)混合至含水率90%左右,然后添加CaO(污泥干基的20%)和FeCl3(污泥干基的3%)調理,最后經板框壓濾至含水率低于60%.

1.2 實驗方法

1.2.1 耐藥細菌的培養

本實驗以LB營養肉湯培養基作為可培養菌落數測定培養基.將四環素加入LB培養基中,制成四環素濃度為20 μg·mL-1的LB培養基作為四環素耐藥菌選擇性培養基.實驗采用在0.85%生理鹽水中添加0.01%焦磷酸鈉作為稀釋緩沖液對水樣進行震蕩破碎,焦磷酸鈉是解絮凝劑,添加的目的是為了將活性污泥中菌膠團打散,以使菌膠團中細菌得到較充分培養.無菌操作取水樣5 mL,放于裝有45 mL滅菌緩沖液的三角燒瓶內,瓶內預置適當數量玻璃珠,恒溫搖床內180 r/min劇烈震蕩2 h,制成稀釋10-1菌液.出水水樣直接震蕩,不經過稀釋.用1 mL滅菌移液吸管吸取稀釋液1 mL,緩慢注入含有9 mL滅菌緩沖液的試管內,震蕩試管混合均勻,制成10-2稀釋菌液.同法依次連續稀釋至10-3、10-4、10-5稀釋菌液.針對每個采樣點水樣選擇3個適宜稀釋度,每個稀釋梯度做3個平行樣,吸取0.1 mL稀釋菌液,加在已滅菌的培養皿中,涂布法涂布均勻,37 ℃恒溫生化培養箱中培養24 h后計數,以上無菌操作均在超凈臺中進行.

1.2.2 四環素耐藥基因測定

采用Real-time PCR絕對定量法,以細菌16S V3區通用引物357F、518R擴增總菌為內參照,檢測不同水環境中這些耐藥基因絕對含量,并與總菌相對照.設計耐藥基因tet(A)、tet(B)、tet(M)和tet(X)特異性引物,并構建絕對定量質粒檢測不同水環境中這些耐藥基因絕對含量,并與總菌相對照.引物序列由Primer Premier 5.0軟件設計,目的基因片段及方法如表1所示.

表1 4種耐藥基因測定的引物和方法設定[16]

2 結果與討論

2.1 污泥深度脫水前后性質

對深度脫水污泥的理化性質進行分析,結果見表2和圖1.

表2 深度脫水污泥脫水前后理化特性

污泥填埋場內深度脫水污泥為顆粒狀和塊狀,呈灰黃色,結構松散,密實性較差,含有少量塑料薄膜碎片,由于調理過程投加大量CaO形成堿性環境,伴有強烈的氨氣臭味.

2.2 污泥深度脫水對四環素耐藥菌的影響

污泥脫水前后四環素耐藥菌的變化見表3.

表3 污泥脫水前后四環素耐藥菌的變化

從表3可以看到,污泥深度脫水前后四環素耐藥菌均存在,經深度脫水處理后可培養菌落總數及四環素耐藥菌落數都呈下降趨勢,說明深度處理對四環素耐藥菌有一定的去除效果.污泥調理過程中,除了通過改變斥力,壓縮內部結合水外,還由于在調理過程中,pH大幅上升至堿性,改變細菌結構或破壞細胞,從而去除或者殺死了耐藥菌.四環素耐藥菌占總菌落數的百分比沒有明顯下降或上升,相比于脫水前的33.5%,出水仍然保持在31.8%左右.說明深度脫水沒有選擇性地富集或去除四環素耐藥菌.

2.3 四環素耐藥基因的去除特性

熒光定量PCR測定耐藥基因的原理是隨著PCR反應的進行,PCR反應產物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加.每經過一個循環,收集一個熒光強度信號,這樣就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖.實驗獲得的總菌(內參)定量標準品擴增曲線圖見圖1.

圖1 總菌內參定量標準品擴增曲線(橫坐標為循環次數,縱坐標為熒光強度)

污泥深度脫水前,總菌的基因拷貝數是4.21×108copies/mL,污泥深度脫水后,總菌的基因拷貝數是4.21×108copies/mL,去除率是59.62%.tetA,tetB,tetM和tetX的濃度和去除效率如圖2所示.

從圖2中可以看出:

(1) 污泥深度脫水前后中4種四環素耐藥基因均被檢出,4種四環素耐藥基因濃度在經歷深度脫水后都有一定程度的下降,其中tetA,tetB,tetM的去除率能達到80%以上,但是tetX的去除率較低,只有45.6%.

(2) 污泥深度脫水過程中四環素耐藥基因濃度遠低于總菌濃度,兩者相差1～4個數量級.總菌基因的去除率為59.6%,相對tetA,tetB,tetM來說較低.

(3) 污泥深度脫水后四環素耐藥基因并沒有全部去除,尤其是tetX的去除率較低,說明經過污泥深度脫水處理后,污泥中的耐藥基因還會對環境造成潛在風險.

圖2 耐藥基因的濃度和去除效率

3 結 論

(1) 污泥深度脫水前后四環素耐藥菌均存在,經深度脫水處理后可培養菌落總數及四環素耐藥菌落數都呈下降趨勢,說明深度處理對四環素耐藥菌有一定的去除效果.但是深度脫水沒有選擇性地富集或去除四環素耐藥菌.

(2) 四環素耐藥基因濃度在經歷深度脫水后都有一定程度的下降,其中tetA,tetB,tetM的去除率能達到80%以上.

(3) 污泥深度脫水處理后不能完全去除耐藥基因,污泥中的耐藥基因還會對環境造成潛在風險.

參考文獻:

[1] 張辰.污泥護理處置技術與工程實例[M].北京:化學工業出版社,2006.

[2] TYAGI V K,LO S L.Sludge:A waste or renewable source for energy and resources recovery[J].Renewable and Sustainable Energy Reviews,2013,25:708-728.

[3] 陳濤,孫水裕,劉敬勇,等.城市污水污泥焚燒二次污染物控制研究進展[J].化工進展,2010,29(1):157-167.

[4] 唐小輝,趙力.污泥處置國內外進展[J].環境科學與管理,2005,30(3):68-74.

[5] FROLUND B,PALMGREN R,KEIDING K,et al.Extraction of extracellular polymers from activated sludge using a cation exchange resin[J].Water Research,1996,30:1749-58.

[6] GUARDABASSI L,DIJKSHOORN L,COLLARD J M,et al.Distribution and in-vitro transfer of tetracycline resistance determinants in clinical and aquatic Acinetobacter strains[J].J Med Microbiol,2000,49:929-936.

[7] PRADO N,OCHOA J,ABDELTIF A.Biodegradation and biosorption of tetracycline and tylosin antibiotics in activated sludge system[J].Process Biochem,2009,44(11):1302-1306.

[8] PRADO N,OCHOA J,ABDELTIF A.Biodegradation by activated sludge and toxicity of tetracycline into a semi-industrial membrane bioreactor[J].Bioresource Technology,2009,100(15):3769-3774.

[9] 姚萌,程國淡,謝小青,等.城市污水廠污泥化學調理深度脫水機理[J].環境工程學報,2012(6):2787-2790.

[10] 魏源送,樊耀波.污泥減量技術的研究及其應用[J].中國給水排水,2001,20(7):23-26.

[11] 楊造燕,匡志花,顧平,等.膜生物反應器無剩余污泥排放的研究[J].城市環境與城市生態,1999,12(1):16-18.

[12] KUMMERER K.Significance of antibiotics in the environment[J].Journal of Antimicrobial Chemotherapy,2003,52(1):5-7.

[13] MO L,S LC S,Antibiotic prescription rates vary markedly between I3 European countries[J].Scand J Infect Dis,2002,34(5):366-371.

[14] KUMMERER K A A,Biodegradability of some antibiotics,elimination of their genotoxicity and affection of 135 waste water bacteria in a simple test[J].Chemosphere,2000,40(7):701-710

[15] MUNIR M,WONG K,XAGORARAKI I.Release of antibiotic resistant bacteria and genes in the effluent and biosolids of five wastewater utilities in Michigan[J].Water Research,2011,45:681-693.

[16] ZHANG W,HUANG M H,QI F F,et al.Effect of trace tetracycline concentrations on the structure of a microbial community and the development of tetracycline resistance genes in sequencing batch reactors[J].Bioresource Technology,2013,150:9-14.