乳苣水提取物誘導肺癌細胞H1299和A549的凋亡

張彩艷,劉小敏,華子義,賀燕云

(上海大學 生命科學學院,上海 200444)

據世界衛生組織(WHO)統計,全世界每年有1000萬新發癌癥患者,600萬人死于癌癥,癌癥幾乎是死亡的代名詞.目前,治療癌癥的措施有手術、化療、放療和免疫治療等方法,但其治療效果都不理想.由于中藥的毒副作用低,能提高機體的免疫力,所以越來越多的中晚期癌癥患者選擇中藥治療,許多報道也證明了中藥在抗腫瘤復發、轉移中的優勢.因此尋找能預防癌癥并能長期服用的高效無毒的中草藥成為迫切的問題.

藥食兩用植物乳苣(Mulgediumtataricum(Linn.) DC.)為菊科乳苣屬植物,又名蒙山萵苣、紫花山萵苣、苦菜等,多年生草本植物,民間作為野菜采食,有抗菌、消炎、止痛等功效.已有的對乳苣的研究主要集中在對乳苣的總黃酮和多酚的提取和抗氧化方面的研究[1-4].天然的黃酮類化合物具有抗心腦血管疾病、抗炎鎮痛、免疫調節、降血糖、治療骨質疏松,它具有清除自由基、超氧化物和羥基自由基、抑制脂質過氧化及抗癌、抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗輻射等作用[5-6].王小雄等從乳苣全草中分離到41種化合物,其中3種物質萵苣素-8-O-對甲氧基苯乙酸酯、萵苣素、山萵苣素被實驗證明能夠抑制體外培養的人的白血病細胞(HL-60)和人肝癌細胞(SMMC-7721)的生長[7-8].本文作者想要驗證乳苣作為中草藥對癌細胞的抑制作用,所以直接用沸水浸泡乳苣所得的水提取物作用于體外培養的人肺癌細胞株H1299和A549,探討乳苣的水提取物對腫瘤細胞的生長抑制及誘導細胞凋亡的作用,為保健品和新藥的研究開發提供線索.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株

人肺癌細胞株H1299和A549;購自中國科學院上海細胞生物學研究院.

1.1.2 主要試劑

乳苣(Mulgediumtataricum(Linn.) DC.)為菊科乳苣屬植物,采于晉西北農田,由上海大學生命學院王偉博士鑒定.RPMI-1640培養基(CORNING);胎牛血清(Hyclone);胰蛋白酶(Hyclone);Penicillin-Streptomycin Solution(Hyclone);CCK-8試劑盒(上海七海復泰生物公司);Annexin V-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒(上海七海復泰生物公司);線粒體膜電位檢測試劑盒(Jc-1)(碧云天生物公司).

1.1.3 主要儀器

流式細胞儀為Moflow XDP;CO2培養箱;酶標儀為美國BioRad產品;倒置顯微鏡為LEICA 公司產品;冷凍干燥機為美國LABCONCO公司產品.

1.2 實驗方法

1.2.1 乳苣水提取物制備

采全草,陰干,-80 ℃保存.將8 g的干乳苣,粉碎,浸泡到100 mL沸水中,超聲1 h,沸水浴30 min,過濾2次,分裝原液經48 h冷凍干燥后制成凍干粉,-80℃保存,備用.使用時,用培養基重新溶解凍干粉,0.22 μm濾膜過濾后使用.

1.2.2 細胞培養

以含10%新生牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養基培養H1299和A549,37 ℃、5 % CO2,恒溫培養箱中常規消化傳代.

1.2.3 細胞形態觀察

細胞均勻鋪在24孔板中,待細胞貼壁生長至覆蓋培養板底部50%～60%時,用不同濃度乳苣水提取物處理細胞48 h,另設不加藥的空白對照,每個劑量設3個重復,在光學顯微鏡下觀察細胞形態.

1.2.4 細胞增殖活力檢測(CCK-8法)

將細胞均勻鋪于96孔板中,待細胞貼壁生長至覆蓋培養板底部50%～60%時,用不同濃度乳苣水提取物處理細胞48 h,檢測前4 h先換無血清培養基培養,每孔加5 μL CCK-8溶液,避光溫育1～2 h,用酶標儀測450 nm下的吸光值,每個劑量重復4次,實驗重復3次.

1.2.5 Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡

不同濃度乳苣水提取物處理細胞48 h后收集到的細胞,取200 μL loading buffer懸浮細胞,2.5 μL FITC染色,室溫避光處理15 min,再用5 μL PI染色,冰浴避光處理5 min后上流式細胞儀檢測,用Summit 5.2 獲取數據并分析.

1.2.6 細胞膜電位的檢測

不同濃度乳苣水提取物處理細胞48 h后收集到的細胞,加入Jc-1染色工作液后,避光溫育20 min.染色完成后,用1 mL Jc-1(5X)與4 mL超純水比例配制的Jc-1(1X)洗滌緩沖液(冰浴)洗滌2遍后流式細胞儀檢測,用試劑盒提供的CCCP作為誘導線粒體膜電位下降的陽性對照.用FL1(FITC)和FL2(RPE-TR)通道接收信號.

1.2.7 統計學處理

所得數據采用GraphPad Prism5軟件進行統計學分析,以P<0.05為差異具有統計學意義.

2 結 果

2.1 乳苣水提取物對H1299和A549細胞形態的影響

如圖1所示,不同濃度乳苣水提取物分別作用H1299和A549細胞48 h后,光鏡下直接可見未給藥對照組細胞貼壁狀況良好,細胞透明,折光性好;濃度達到1.2 mg/mL的處理組密度明顯降低,細胞貼壁能力減弱,細胞皺縮,出現了明顯的凋亡形態學特征.

圖1 不同濃度乳苣水提取物對H1299和A549細胞生長的影響 (A:H1299; B:A549)

2.2 乳苣的水提取物明顯抑制了H1299和A549細胞的增殖

如圖2所示,乳苣水提取物作用H1299和A549細胞48 h后,對細胞的增殖有明顯的抑制作用.乳苣對H1299增殖的抑制作用與其劑量、作用時間呈正相關,實驗組的增殖抑制作用與空白對照組比較,均有顯著性差異(P<0.05).對于A549細胞,處理濃度達到1.2 mg/mL時,細胞的增殖抑制程度與空白對照組比較,有顯著性差異(P<0.05).

2.3 乳苣水提取物誘導H1299和A549細胞的凋亡

在細胞凋亡的早期階段,胞漿膜磷脂的不對稱性喪失,導致膜內側磷脂酰絲氨酸(PS)從細胞膜內層暴露于外層,從而可被PS特異的AnnexinV探針所標記,PI不能透過完整的細胞膜,但在凋亡中晚期的細胞和死細胞,PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染.因此將Annexin-V與PI匹配使用,就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來.流式AnnexinV-FITC/PI雙參數圖(圖3,4)可見,右下象限(FITC+/PI-)和右上象限(FITC+/PI+)分別代表細胞的早期凋亡和晚期凋亡,左下象限為活細胞(FITC-/PI-),左上象限為壞死細胞(FITC-/PI+).不同劑量的乳苣水提取物作用H1299細胞的平均凋亡率分別為10.5%、13.36%、15.36%、21.2%、36.01%、96%,作用A549細胞的平均凋亡率分別為8.31%,7.33%,15.56%,44.2%,46.82%,當處理濃度達到1.2 mg/mL,作用48 h后,處理組凋亡率與對照組相比均有顯著性意義(P<0.05).

圖2 不同濃度乳苣的水提取物對H1299和A549細胞增殖的影響

圖3 不同濃度乳苣的水提取物作用H1299細胞凋亡的檢測

圖4 不同濃度乳苣的水提取物作用A549細胞凋亡的檢測

2.4 乳苣水提取物處理H1299和A549細胞后細胞膜電位下降

線粒體膜電位的下降是細胞凋亡的一個標志性事件[9].在線粒體膜電位較高時,探針JC-1聚集在線粒體的基質中,形成聚合物,產生紅色熒光;在線粒體膜電位較低時,JC-1不能聚集在線粒體的基質中,此時JC-1為單體,產生綠色熒光.因此可通過熒光顏色的轉變來檢測線粒體膜電位的變化.如圖5所示活細胞線粒體膜電位高,線粒體內JC-1聚合物的濃度高,紅色熒光很強,在流式圖上表現為雙陽性,而凋亡細胞則大多為FITC單陽性.用帶紅色熒光信號的細胞比例的下降來表示線粒體去極化程度,乳苣水提取物處理H1299和A549 48 h后,經JC-1染色,雙陽性細胞隨著藥物濃度的增加逐漸減少,表明乳苣水提取物處理細胞后,細胞的膜電位明顯下降,結合前期的實驗結果表明乳苣確實能誘導肺癌細胞H1299和A549凋亡.

圖5 不同濃度乳苣水提取物作用H1299和A549細胞膜電位的變化 (A:H1299; B:A549)

3 討 論

近年我國各類癌癥發病率日益上升,迫切需要找出既能抑制癌細胞增殖又對人體危害較少的藥物,因此開發天然抗癌藥物成為研究熱點.本研究中的菊科乳苣屬植物乳苣(Mulgediumtataricum(Linn.) DC.)為藥食兩用野生植物,我國晉西北人長期采食,以其特有的苦寒屬性及所含成份,煮熟放置后長期不餿、食后具有泄熱寧神、清心明目、消炎解毒作用.由于苦菜的食用方法多為沸水煮食或陰干后泡食,所以實驗材料用陰干的乳苣全草的水浸泡提取物作用于癌細胞,以此探索乳苣水溶狀態下對癌細胞的作用.這樣的研究為開發乳苣這種食用野菜,尋找預防和治療癌癥的新藥物提供理論基礎.

圖6 不同濃度乳苣水提取物作用H1299和A549細胞,細胞內活性氧水平檢測 (A:H1299; B:A549)

本實驗觀察了乳苣水提取物對體外培養的肺癌細胞H1299和A549生長、增殖、凋亡的影響.雖然低濃度劑量組(0.4 mg/mL)在細胞形態和增殖活力檢測的結果中與對照組相比差異不是很明顯,但是流式的檢測結果表明,當濃度低至0.4 mg/mL時,乳苣水提取物作用48 h對H1299細胞有誘導凋亡的作用,但當濃度達到1.2 mg/mL時才能明顯地誘導A549細胞的凋亡.本實驗中同時觀察了另外一種十字花科蕓薹屬蔬菜青菜對這兩株細胞生長的影響,用同樣方法處理材料,高濃度(2 mg/mL)的青菜水提取物處理肺癌細胞H1299和A549 48 h后卻能很明顯地促進細胞的生長(結果未顯示).由于乳苣這種食用植物中同樣也含有有利于細胞生長的營養成分,低濃度時促進細胞生長,但高劑量的乳苣提取物,抑癌活性物質的濃度也會增加,這些活性物質誘導了細胞的凋亡,而青菜中并不含有抑制肺癌細胞生長的活性物質,所以較高濃度下并不能誘導癌細胞凋亡,說明乳苣這種食用野菜中確實含有能抑制癌細胞生長的活性物質.

所有數據表明乳苣水提取物可以明顯地抑制體外培養的肺癌細胞H1299和A549的增殖,而這種抑制作用可能是通過誘導細胞凋亡實現的,藥物處理后細胞膜電位的下降說明這種凋亡可能是線粒體凋亡途徑介導的.后期將對乳苣水提取物誘導肺癌細胞H1299和A549凋亡的機制和對體內生長的細胞的影響做進一步研究,這對臨床應用將有十分重要的指導意義.

參考文獻:

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