一株枯草芽孢桿菌對芘的降解特性及代謝途徑的研究

姚 俊，喻 嬋，靳競男

（北京科技大學土木與環境工程學院環境與能源國際合作基地，北京100083）

多環芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是常見的一類環境污染物［1－2］，廣泛分布于水體、空氣及土壤中。由于其在環境中的半衰期較長和致癌、致畸、致突變的性質而日益受到人們的重視［3］。PAHs具有較低的水溶性［4］，高分子量的PAHs在環境中的存留時間較長，導致這類化合物在環境中很難被去除［5］。美國環保局在20世紀80年代初將16種未帶分支的PAHs確定為環境中的優先控制污染物［6］。利用微生物去除環境中的PAHs因費用低、易操作及不造成二次污染而逐漸成為研究熱點［7］。

作者從大港油田原油樣品中篩選獲得1株可以以芘（代表性PAHs）作為唯一碳源和能源進行生長的菌株，對其降解特性和降解產物進行了測定，進一步提出了該菌株對芘的降解代謝途徑。

1 實驗

1.1 樣品及培養基

原油樣品取自大港油田港西區塊58－8－3＃油井。

無機鹽培養基（g·L－1）［8］：（NH4）2SO43，KH2PO40.5，Na2HPO4·12H2O 1.26，MgSO4· 7H2O 0.54，FeCl3·6H2O 0.05，FeSO4·7H2O 0.03，MnSO4·H2O 0.015，ZnSO4·7H2O 0.024，CoCl2· 6H2O 0.366，調節pH值至7.2～7.4。固體培養基中添加2%的瓊脂，121℃滅菌30min。

LB培養基（g·L－1）：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，調節pH值至7.0。固體培養基中添加2%的瓊脂，121℃滅菌30min。

1.2 菌種篩選

將樣品以2%的接種量接種于以芘為唯一碳源的無機鹽培養基中，好氧條件下于28℃、180r·min－1搖床培養7d，相同條件下轉接1次。采用稀釋涂平板法涂于以芘為唯一碳源的無機鹽固體培養基上，于28℃恒溫搖床培養7d形成單菌落。挑取生長迅速、邊緣整齊的菌落接入無機鹽培養基中，搖瓶復篩，得到目的菌株。

1.3 芘降解菌株的鑒定

將目的菌株在28℃LB培養基中振蕩培養至對數生長期，取1.5mL培養液以12 000r·min－1離心，收集菌體。采用OMEGA公司提供的細菌基因組DNA小量快速提取試劑盒提取該菌株的總DNA，將其置于－20℃保存，備用。

以總DNA為模板，采用引物27F（5′－AGAGTT TGATCCTGGCTCAG－3′）和1492R（5′－GGTTACCTTGTTACGACTT－3′）［9］進行PCR擴增。反應體系20μL，其中PCR mix 10μL，總DNA 0.5μL，正、反引物各0.4μL，ddH2O 8.7μL。PCR擴增程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，35個循環；最后72℃延伸10min。PCR產物經過純化后，進行瓊脂糖凝膠電泳。

16SrDNA序列由華大基因公司測定。測定結果在GenBank上與已知種屬的16SrDNA序列進行Blast比對［10］，利用Mega4對獲得的同源性序列進行分析并構建系統進化樹。

1.4 菌株生長曲線的測定

目的菌株經LB液體培養基活化后，取1mL菌液接種于芘濃度為100mg·L－1的50mL無機鹽培養基中進行培養，待OD600≈0.25時，以2%的接種量接入以芘為唯一碳源的無機鹽培養基中，于28℃、180r ·min－1進行培養，每個樣品做3個平行，以未接菌株的無機鹽培養基為空白，每2d測1次OD600。

1.5 芘降解率的測定

活化菌株在芘濃度為100mg·L－1的培養基中進行培養，待OD600≈0.25時，以2%的接種量接入以芘為唯一碳源的無機鹽培養基中，于28℃、180r· min－1進行培養。取5mL正己烷與5mL菌液混合，超聲數分鐘后，靜置約10min分層。收集上層有機相和下層水相。重復此操作2次，合并有機相，棄下層水相。將有機相過無水硫酸鈉柱除去水分，蒸發濃縮至2mL，進行GC－MS分析。

1.6 芘降解代謝產物的測定

GC－MS條件：進樣口無分流模式，溫度250℃，HP－5彈性石英毛細管色譜柱（30m×0.25mm，0.25 μm），柱子流量為1.1mL·min－1，爐溫60℃保持1 min，以15℃·min－1升到150℃保留1min，再以6℃·min－1升到320℃保留10min。進樣口和檢測器的溫度分別為250℃和300℃。載氣（氦氣）流速為1.1mL·min－1。空白樣品為未接菌的樣品。

2 結果與討論

2.1 菌株的鑒定

經過富集、馴化及純化，篩選得到1株芘降解菌株，命名為USTB－Y。菌體形態為桿狀，菌落呈圓形，邊緣呈鋸齒狀，中間凸起，乳黃色，表面光滑，濕潤。

將測得的16SrDNA序列在GenBank中進行Blast比對，獲得的同源性序列均為Bacillus屬，其中與Bacillus amyloliquefaciens strain BC7的同源性高達97%。進一步構建系統進化樹，確定該菌株在所屬種屬中的親緣關系，如圖1所示。

圖1 芘降解菌USTB－Y的系統進化樹Fig.1 Phylogenetic positions of USTB－Y on 16SrDNA analysis

從圖1可以看出，USTB－Y和Bacillus amyloliquefaciens strain BC7的親緣關系最近，可以推斷此菌株屬于芽孢桿菌屬。

2.2 菌株USTB－Y對芘的降解特性（圖2）

圖2 菌株USTB－Y的生長曲線及芘降解率隨時間變化曲線Fig.2 The growth curve of strain USTB－Y and the variation curve of pyrene degradation rate with time

從圖2可以看出，菌株USTB－Y在以芘為唯一碳源的無機鹽培養基中生長經歷延遲期、對數期、穩定期及衰亡期這4個時期，在第8d時生長速率達到最快，OD600值為0.206，較以LB為培養基時的生長速率慢，可能是由于無機鹽培養基是一種缺陷型培養基，細菌在此培養基中生長能力較差。

從圖2還可以看出，菌株USTB－Y逐漸降解芘，在16d時對芘的降解率高達約56%，由于此時培養基中的菌株大部分處于衰亡期，所以基本認為測定的降解率為最高。表明，USTB－Y是1株能夠有效降解芘的菌株。

2.3 芘降解代謝產物的測定

通過GC－MS分析，檢測到菌株USTB－Y對芘的降解過程中產生的一系列代謝產物，如圖3所示。

從圖3可以看出，檢測到的代謝產物有1－羥基芘、芘酮、鄰苯二甲酸酯和1－羥基苯。

根據所檢測到的代謝產物，參考Bacillus amyloliquefaciens strain BC7，推測菌株USTB－Y降解芘可能存在的代謝途徑，如圖4所示。

圖3 菌株USTB－Y降解芘的代謝產物Fig.3 The metabolites formed from pyrene utilization by strain USTB－Y

圖4 菌株USTB－Y降解芘的可能代謝途徑Fig.4 Proposed pathway for the degradation of pyrene by strain USTB－Y

從圖4可以看出，菌株USTB－Y以芘為唯一碳源和能源進行生長的過程中，芘的芳香環上4位的碳首先受到單加氧酶或雙加氧酶的攻擊，形成水二醇；進一步轉化為1－羥基芘，接著轉化為芘酮或其它代謝產物；再進一步降解形成鄰苯二甲酸酯，轉化為鄰苯二甲酸，最終進入三羧酸循環被完全降解。

3 結論

自大港油田港西區塊58－8－3＃油井原油樣品中篩選得到1株能以芘為唯一碳源和能源生長的菌株USTB－Y。形態鑒定及16SrDNA鑒定表明，此菌株屬于芽孢桿菌屬，與Bacillus amyloliquefaciens strain BC7的同源性高達97%。對其生長曲線及對芘的降解率測定表明，在以芘為唯一碳源的無機鹽培養基中培養16d后，芘的降解率高達56%，被認為是對芘具有高效降解效果的菌株。進一步對菌株USTB－Y降解芘的代謝產物進行測定，提出了該菌株降解芘的可能代謝途徑。

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