交聯肌酸激酶聚集體催化合成磷酸肌酸

徐紅梅，何從林，熊文娟，韋燕禪，夏仕文

（重慶郵電大學生物信息學院，重慶400065）

磷酸肌酸（phosphocreatine，PCr）是參與細胞能量代謝的重要物質之一，具有重要的藥理作用，如用于心臟外科手術病人術后心臟功能恢復、治療心肌梗塞等［1］。磷酸肌酸的制備方法主要有化學法和酶催化法。最早的化學法以肌酸和三氯氧磷為原料合成磷酸肌酸［2］，存在反應條件苛刻、成本高、產率低且環境污染嚴重等問題，尤其是鋇鹽的引入增加了制劑的危險性。美國專利［3］采用S－甲基異硫脲為原料，以二芐氧基磷?；?、氧化得到氰基磷酰胺，后者與肌氨酸縮合脫芐基再水解得到磷酸肌酸。湯磊等［4］以肌酐為原料，與二苯氧基磷酰氯縮合得到二苯氧基磷酰肌酐，再用二氧化鉑催化氫解脫去苯基，得到磷酸肌酐二鈉鹽，經堿性水解得到磷酸肌酸，總收率35.5%。

肌酸激酶（creatine kinase，CK）是一種轉移性磷?；福趬A性條件下可逆性催化肌酸和三磷酸腺苷（ATP）的轉磷?；磻闪姿峒∷岷投姿嵯佘眨ˋDP），用于合成磷酸肌酸具有反應條件溫和、成本低廉、環境友好等特點［5］。但游離肌酸激酶只能一次性使用，而且作為外源蛋白會帶來分離困難、可能與磷酸肌酸原料藥和制劑發生免疫原性反應等問題。

為尋求更理想的磷酸肌酸酶法合成工藝，作者提出一種新的肌酸激酶無載體固定化方法制得交聯肌酸激酶聚集體，并以肌酸和ATP為原料、交聯肌酸激酶聚集體為催化劑合成磷酸肌酸（圖1）。

圖1 交聯肌酸激酶聚集體催化合成磷酸肌酸Fig.1 Synthesis of phosphocreatine catalyzed by cross－linked creatine kinase aggregates

1 實驗

1.1 試劑

肌酸，鄭州皇朝化工產品有限公司；ATP，湖北鴻運隆藥業有限公司；磷酸肌酸、ADP、葡聚糖（MW＝40 000，國藥集團化學試劑有限公司；其余試劑均為市售國產分析純或色譜純。

1.2 方法

1.2.1 肌酸激酶的分離純化

按文獻［6］方法從兔肌中分離純化肌酸激酶。

1.2.2 交聯肌酸激酶聚集體的制備

取2g葡聚糖溶于50mL蒸餾水中，加入2.4g高碘酸鈉，室溫攪拌90min，反應液透析至酸性淀粉碘化鉀溶液檢查無藍色，得56mL氧化葡聚糖溶液；向20mL肌酸激酶酶液中加入60mL 95%乙醇，4℃下攪拌2h，得到肌酸激酶聚集體；再向其中加入40 mL氧化葡聚糖溶液，室溫下反應12h；最后加入20 mL 1mg·mL－1硼氫化鈉溶液，攪拌反應2h，固體用純水洗滌2～3次，得到交聯肌酸激酶聚集體。

1.2.3 酶催化反應

在含有60mmol·L－1肌酸、20mmol·L－1ATP和25mmol·L－1醋酸鎂的300mL 0.1mol·L－1甘氨酸－氫氧化鈉緩沖溶液（pH值9.0）中，加入36g交聯肌酸激酶聚集體（濕重），30℃下振蕩反應6h。反應過程中通過滴加2mol·L－1氫氧化鈉溶液控制反應體系的pH值為9.0。

1.2.4 蛋白質測定

酶蛋白濃度采用Bradford［8］分光光度法測定，以牛血清白蛋白為標準。

1.2.5 酶活測定

在含有60mmol·L－1肌酸、20mmol·L－1ATP和25mmol·L－1醋酸鎂的20mL 0.1mol·L－1甘氨酸－氫氧化鈉緩沖溶液（pH值9.0）中，加入適量游離酶、相當酶量的肌酸激酶聚集體或交聯肌酸激酶聚集體，30℃下振蕩反應10min，加2mol·L－1鹽酸溶液終止反應。采用HPLC測定磷酸肌酸的量，計算酶活。

1個酶活單位定義為：30℃下1min內催化生成1μmol磷酸肌酸對應的酶量（mg）。

1.2.6 分析方法

HPLC色譜條件：C18色譜柱（250mm×4.6 mm），流動相20mmol·L－1磷酸鹽緩沖溶液（pH值6.6），流速1mL·min－1，檢測波長210nm，柱溫25℃。采用HPLC同時測定磷酸肌酸、肌酸、ATP和ADP。

2 結果與討論

2.1 交聯肌酸激酶聚集體制備條件的優化

2.1.1 沉淀劑的影響

比較了硫酸銨、叔丁醇、聚乙二醇－6000、乙醇等沉淀劑對肌酸激酶聚集體形成的影響，結果見表1。

表1 沉淀劑對肌酸激酶沉淀率和相對酶活性的影響／%Tab.1 Effect of precipitant on creatine kinase precipieation rate and relative enzyme activity／%

由表1可知，以50%叔丁醇為沉淀劑時，不能形成肌酸激酶聚集體；以80%硫酸銨、20%聚乙二醇－6000為沉淀劑時，肌酸激酶的沉淀率較低，分別只有20%和10%；以95%乙醇為沉淀劑時，沉淀率達到90%，與游離酶相比的相對酶活性為65%。故選擇適宜的沉淀劑為95%乙醇。

2.1.2 交聯劑的影響

分別以戊二醛、京尼平、氧化葡聚糖為交聯劑對乙醇沉淀的肌酸激酶聚集體進行共價交聯，考察交聯劑對交聯肌酸激酶聚集體活性的影響，結果見表2。

表2 交聯劑對交聯肌酸激酶聚集體相對酶活性的影響／%Tab.2 Effect of cross－linker on relative enzyme activity of cross－linked creatine kinase aggregates／%

由表2可知，小分子交聯劑戊二醛、京尼平能夠交聯肌酸激酶聚集體，但相對酶活性很低，采用大分子交聯劑氧化葡聚糖制備的交聯肌酸激酶聚集體具有中等的相對酶活性。故選擇適宜的交聯劑為氧化葡聚糖。

2.2 交聯肌酸激酶聚集體的催化性能

2.2.1 最適反應pH值和pH穩定性

在不同pH值（4.0～12.0）下測定游離酶和交聯肌酸激酶聚集體及在30℃處理2h后的相對酶活性，結果分別見圖2、圖3。

圖2 交聯肌酸激酶聚集體的最適pH值Fig.2 The optimum pH value of cross－linked creatine kinase aggregates

由圖2可知，游離酶和交聯肌酸激酶聚集體的最適pH值分別為9.0和10.0。交聯肌酸激酶聚集體的最適pH值向堿性方向偏移了1個單位。

由圖3可知，在所選擇的pH值范圍內尤其是在堿性條件下，交聯肌酸激酶聚集體的穩定性明顯高于游離酶。

2.2.2 最適溫度和溫度穩定性

在不同溫度（10～60℃）下測定游離酶和交聯肌酸激酶聚集體及在pH值9.0、50℃下處理不同時間的相對酶活性，結果分別見圖4、圖5。

圖3 30℃下處理2h的交聯肌酸激酶聚集體的pH穩定性Fig.3 The pH stability of cross－linked creatine kinase aggregates treated at 30℃for 2h

圖4 交聯肌酸激酶聚集體的最適溫度Fig.4 The optimum temperature of cross－linked creatine kinase aggregates

由圖4可知，游離酶的最適溫度為40℃，交聯肌酸激酶聚集體的最適溫度為50℃，交聯肌酸激酶聚集體的最適溫度提高了10℃。

圖5 50℃下交聯肌酸激酶聚集體的熱穩定性Fig.5 The thermal stability of cross－linked creatine kinase aggregates treated at 50℃

由圖5可知，游離酶和交聯肌酸激酶聚集體的相對酶活性隨處理時間的延長而急劇下降，30min時分別為50%和85%；180min時游離酶幾乎完全失活，交聯肌酸激酶聚集體仍有25%活性保留。顯然，交聯肌酸激酶聚集體的熱穩定性明顯高于游離酶。

2.2.3 交聯肌酸激酶聚集體的操作穩定性

測定交聯肌酸激酶聚集體催化合成磷酸肌酸的時間進程，結果見圖6。

圖6 交聯肌酸激酶聚集體催化合成磷酸肌酸的時間進程Fig.6 The time course of synthesis of phosphocreatine catalyzed by cross－linked creatine kinase aggregates

由圖6可知，反應4h后達到平衡，轉化率（以ATP計）為74%。

反應液中磷酸肌酸、肌酸、ATP和ADP的HPLC分離效果見圖7。

圖7 反應液中磷酸肌酸、肌酸、ATP和ADP的HPLC分離效果Fig.7 Separation of phosphocreatine，creatine，ATP and ADP in reaction solution by HPLC

由圖7可知，HPLC分離反應液中磷酸肌酸、肌酸、ATP和ADP效果良好，保留時間分別為2.7min、3.6min、4.3min和4.8min。

將交聯肌酸激酶聚集體與肌酸、ATP在30℃、pH值9.0的條件下，混合反應4h，用Tris－HCl緩沖溶液（pH值9.0）充分洗滌后測定酶活，考察固定化酶的重復使用穩定性，結果見圖8。

由圖8可知，交聯肌酸激酶聚集體使用4批次后，酶活保留90%以上；使用12批次后，酶活仍保留50%以上。

圖8 交聯肌酸激酶聚集體的操作穩定性Fig.8 The operational stability of cross－linked creatine kinase aggregates

2.3 討論

制備交聯酶聚集體通常以戊二醛為交聯劑［8］，大分子交聯劑的運用鮮有報道［9］。兔肌肌酸激酶是二聚體，由2個相同亞基組成，每個亞基又由387個氨基酸殘基組成，每個酶分子中存在8個巰基。本研究發現：以戊二醛為交聯劑時，由于其高反應性和小尺寸，會與作為肌酸激酶結合或催化位點的巰基反應導致失活；以大分子多醛如氧化葡聚糖為交聯劑時，肌酸激酶的相對酶活性很高?？赡苁且驗槌叽巛^大的氧化葡聚糖較難進入肌酸激酶的活性腔與催化相關的半胱氨酸殘基反應，因而有較高的相對酶活性。

肌酸激酶可逆性催化肌酸和ATP的轉磷酰化反應，在堿性條件下，正反應的反應速度遠大于逆反應。與游離酶相比，交聯肌酸激酶聚集體具有更高的最適pH值、最適溫度，更好的pH穩定性、熱穩定性以及操作穩定性。通過反應條件如pH值、溫度、交聯肌酸激酶聚集體用量的優化，并結合提高反應底物之一肌酸濃度的策略，能夠有效提高磷酸肌酸的收率。

3 結論

（1）從兔肌中分離純化出肌酸激酶，經95%乙醇沉淀得到肌酸激酶聚集體，再以氧化葡聚糖為交聯劑制備交聯肌酸激酶聚集體，沉淀率為90%，相對酶活性為58%。交聯肌酸激酶聚集體的pH穩定性和熱穩定性顯著高于游離酶。

（2）交聯肌酸激酶聚集體在堿性條件下催化肌酸和ATP合成磷酸肌酸，轉化率（以ATP計）為74%。交聯肌酸激酶聚集體可重復使用12批次。

（3）與采用小分子交聯劑戊二醛相比，以大分子交聯劑氧化葡聚糖制備交聯肌酸激酶聚集體，能顯著減少酶活損失并有效提高其操作穩定性，適合磷酸肌酸的規?；铣?。

［1］ 侯立向.一種心肌保護劑：磷酸肌酸［J］.生物化學與生物物理進展，2003，32（2）：324－327.

［2］ 趙春山.磷酸肌酸鈉的合成研究［J］.哈爾濱理工大學學報，2004，9（4）：124－126.

［3］ JESUS A.Process for the preparation of phosphocreatine and／or phosphocreatinine：US，3036087［P］.1962－05－22.

［4］ 湯磊，王建塔，朱高峰.磷酸肌酸二鈉的制備［J］.中國醫藥工業雜志，2009，40（3）：172－173.

［5］ 侯立向.一種磷酸肌酸的生產方法：中國，ZL02129203.5［P］.2005－07－20.

［6］ 周廣業，陳堅剛，張彤，等.兔肌肌酸激酶的分離純化及部分性質的測定［J］.大學化學，1999，14（4）：35－38.

［7］ BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle dye binding［J］.Anal Biochem，1976，72（7）：248－254.

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