氣體發泡法制備PLLA／BCP多孔復合支架及其性能研究

楊 琦，索進平

（華中科技大學材料科學與工程學院材料成形與模具技術國家重點實驗室，湖北武漢430074）

生物可降解的多孔支架被廣泛用于骨組織工程的研究［1］。理想的骨支架需要有一定的孔徑尺寸、孔隙率、力學性能、細胞附著性能及骨誘導和骨傳導功能［2－4］。聚乳酸（PLLA）因其良好的生物相容性和生物可降解性而被廣泛用于生物醫學領域，其降解產物無毒并且可以通過體內代謝排出［5－6］，但因力學性能及親水性能不足，存在不利于細胞的粘附、缺乏生物活性［7－9］等缺點。雙相磷酸鈣（BCP）陶瓷由羥基磷灰石（HA）和β－磷酸三鈣（β－TCP）制成，結合了HA良好的機械性能、優異的生物相容性、生物活性以及β－TCP與新生骨生長速率相匹配的降解速率，是一種理想的骨組織工程材料［3］，但單純的BCP陶瓷較脆、機械性能差，不能承載負荷，限制了其在骨組織工程中的單獨使用［10］。因此，通過復合有機PLLA與無機BCP材料，使兩者之間相互取長補短，選擇合適的方法有望制備出理想的骨支架材料。

氣體發泡法利用氣體作為致孔劑制備多孔支架，包括物理發泡法和化學發泡法。其中化學發泡法通常以碳酸化合物作為致孔劑。該法制備PLLA多孔支架是通過將致孔劑與PLLA溶液混合成型，置于熱水或檸檬酸溶液中進行發泡最終獲得［9－11］，但所制備PLLA多孔支架的力學性能通常隨著孔隙率的增加而降低，且支架表面的疏水性限制著其在骨支架中的應用。

作者通過共混PLLA和BCP，以碳酸氫銨（AB）作為致孔劑，采用氣體發泡法制備PLLA／BCP多孔復合支架，研究了AB和BCP的含量對支架力學性能以及親水性能的影響。

1 實驗

1.1 BCP陶瓷粉末的制備

先采用濕化學方法制備缺鈣型磷灰石（CDA），再通過高溫爐熔燒獲得BCP陶瓷粉末，具體制備過程［3，12］如下：配制一定體積比的Ca（NO3）2·4H2O和（NH4）2HPO4混合溶液，加入氨水溶液（pH值為12.92）調節其pH值至10.5，110℃油浴加熱（燒瓶內沸騰）反應5h，然后將反應液倒入燒杯中靜置，去掉上層溶液，離心，水洗數次后干燥研磨，最后置于高溫爐中燒結，以5℃·min－1的速度升溫到1 100℃，保溫1h，研磨過篩，得BCP陶瓷粉末。

1.2 PLLA／BCP復合支架的制備

以二氯甲烷作溶劑按1∶15（質量體積比）配制PLLA（Mw＝300 000）溶液，室溫充分溶解后，稱取不同量的BCP粉末到溶液中，混合均勻；再加入不同量、不同粒徑的AB顆粒充分混合，加入到模具中，用過量乙醇進行預沉淀成型；待溶劑揮發后，將半固體放入過飽和的檸檬酸溶液中反應發泡；待無氣體放出后，將固體放入90℃熱水中進一步發泡，用蒸餾水清洗數次后冷凍干燥，得PLLA／BCP復合支架。

1.3 PLLA／BCP復合支架的表征

（1）用X－射線衍射儀（XRD）對所制備的BCP陶瓷粉末進行物相分析。X－射線測試條件為：采用經鎳箔過濾的Cuκα輻射，管電壓為40kV，管電流為40 mA，掃描速率為4°·min－1，步長為0.02°，掃描范圍為5°～85°。

（2）用紅外光譜儀（FTIR）對所制備的BCP陶瓷粉末以及PLLA／BCP復合支架的結構進行表征。采用衰減全反射法，掃描范圍為4 000～500cm－1。

（3）將樣品進行液氮脆斷，噴金處理后用環境掃描電鏡（ESEM）和場發射掃描電鏡（FE－SEM）對樣品的截面形貌進行分析，觀察支架材料的孔隙結構。

（4）采用溶液靜置法測定孔隙率。首先將支架材料浸入體積為V1的乙醇溶液中，浸入后溶液的體積為V2，移除浸過乙醇的支架后剩余溶液的體積為V3，按下式計算孔隙率（P）：

（5）用靜態試驗機測定支架材料的壓縮強度，實驗速度為1mm·min－1，取變形20%的強度為其壓縮強度。

（6）將PLLA與BCP共混鋪膜，通過測量材料表面接觸角來評價材料的親水性。采用靜滴法，待液滴加到樣品表面30s后測定接觸角，測試分辨率為0.01°，測試精度為0.1°。

2 結果與討論

2.1 BCP陶瓷粉末的XRD分析（圖1）

從圖1可以看出，合成的BCP陶瓷粉末由HA和β－TCP兩相組成，2θ在11.16°、22.15°、26.03°、31.95°、32.10°、33.39°、39.99°、46.97°和49.81°出現明顯的尖峰，與標準的HA衍射峰一致（JCPDS No.86－0740）；在13.89°、17.24°、27.97°、31.18°及34.69°出現明顯的尖峰，與標準的β－TCP衍射峰一致（JCPDS No.09－0169），表明合成的陶瓷粉末中沒有其它雜質。

圖1 BCP陶瓷粉末的XRD圖譜Fig.1 XRD Pattern of BCP ceramics powder prepared

2.2 PLLA／BCP多孔復合支架的FTIR分析

圖2是BCP陶瓷粉末、PLLA和PLLA／BCP復合支架的FTIR圖譜。

圖2 BCP陶瓷粉末、PLLA和PLLA／BCP復合支架的FTIR圖譜Fig.2 FTIR Spectra of BCP ceramics powder，PLLA and PLLA／BCP composite scaffold

從圖2可以看出，BCP陶瓷粉末在高頻3 570 cm－1附近出現了微弱的伸縮振動譜帶，這是－OH的特征吸收峰，其特征峰帶出現在3 700～2 500cm－1區域，1 200～550cm－1區域為PO3－4的主要吸收峰，1 018cm－1處為PO34－的伸縮振動峰，598cm－1處為PO3－4的變形振動峰；PLLA在1 752cm－1處為C＝O的伸縮振動峰，1 183cm－1處為C－O－C的伸縮振動峰，1 083cm－1處為（C＝O）C－O的伸縮振動峰，證明其具有O＝C－O結構，2 996cm－1和2 942cm－1處為C－H的伸縮振動峰，1 452cm－1和1 382cm－1處為CH3中C－H的變形振動峰，3 652cm－1附近微弱的伸縮振動峰為－OH的特征吸收峰；PLLA／BCP復合支架中，PLLA和BCP的各吸收峰并沒有發生明顯的變化，表明PLLA和BCP之間并沒有發生化學反應，屬于物理共混。

2.3 PLLA／BCP多孔復合支架的SEM分析

圖3是不同粒徑的致孔劑AB發泡成型的PLLA多孔支架以及未加致孔劑的PLLA膜在不同倍數下 的FE－SEM照片。

圖3 不同粒徑的致孔劑發泡成型的PLLA支架（a，b，c）以及未加致孔劑的PLLA膜（d，e）的FE－SEM照片Fig.3 FE－SEM Images of the PLLA scaffolds prepared with different particle sizes of AB（a，b，c）and PLLA membrane without AB（d，e）

從圖3可以看出：致孔劑AB粒徑小于250μm時，所制備支架材料的孔徑也小于250μm，與AB的粒徑一致，且孔徑形狀受AB顆粒的外觀形狀影響呈不規則狀，為圓形或者橢圓形（圖3a）；AB粒徑在250～500μm之間或大于500μm時，所制備支架材料的孔徑隨著AB粒徑的增大而增大，與AB的粒徑保持一致（圖3b、c）。表明，可以通過調控致孔劑顆粒的粒徑控制支架的孔徑尺寸。未加致孔劑制備出的PLLA膜，其斷裂表面存在分布均勻的微孔圖（3d），在較大放大倍數下，觀察到這些微孔為5～25μm的相互連通的微孔（圖3e），這可能是由于冷凍干燥溶劑的揮發造成的（在其它由氣體發泡法制備的多孔支架的斷裂表面也觀察到這樣的微孔）。研究發現，同時具有大孔和微孔結構的支架材料相對于只有大孔結構的支架材料對骨的愈合作用更加有效，雖然微孔基質不擁有利于細胞生長的孔洞尺寸，但其對于提供支架機械結構強度必不可少［13－14］。尤其是支架尺寸在300～500μm之間時，便于營養物質的運輸以及細胞代謝產物的排除，因而有利于成骨細胞的繁殖。因此，選用粒徑250～500μm的AB進行后續實驗。

圖4是致孔劑AB含量為1g和3g時加入不同含量BCP制備的PLLA／BCP復合支架在相同倍數下的ESEM斷裂形貌照片。

在西語系統中有很多的文體和句型，因此要特別注意商務英語中從句、被動語態等的翻譯，以便與他國的表達方式適應。如翻譯We are a nation that has a government時，應把定語從句融合到整個句子中，譯成“我們是一個有政府的國家”；再如狀語從句，西方國家習慣將時間、條件、原因等放在句尾或句首，但在漢語中狀語位置較固定，常放在主語和謂語間，有時為了表強調也會放在主語前。

圖4 不同AB∶BCP含量比制備的PLLA／BCP復合支架的ESEM照片Fig.4 ESEM Images of PLLA／BCP composite scaffolds prepared with different content ratios of AB to BCP

從圖4可以看出，PLLA／BCP復合支架的孔徑尺寸均在250～500μm之間，與AB的粒徑保持一致；隨著AB含量的增加，支架上明顯可見的單個孔洞開始相互連通（圖4a和d），孔洞之間的界限變得模糊（圖4b和e、c和f）；BCP比較均勻地混合到PLLA中，BCP的混入并沒有影響支架的孔徑尺寸，支架孔徑仍然保持在250～500μm之間（圖4a、b、c）；且BCP含量的增加對支架孔徑尺寸影響不大（圖4b、d、e、f）。

2.4 PLLA／BCP多孔復合支架的孔隙率和力學性能分析

不同含量的AB和BCP制備的PLLA／BCP多孔支架的孔隙率和壓縮強度見圖5。

圖5 不同含量的AB和BCP制備的PLLA／BCP復合支架的孔隙率（a）和壓縮強度（b）Fig.5 The porosity（a）and compressive strength（b）of PLLA／BCP composite scaffolds prepared with different contents of AB and BCP

從圖5a可以看出，隨著致孔劑AB含量的增加，PLLA／BCP復合支架的孔隙率明顯增大，從52.2%增加到82.1%，達到了理想骨支架所要求的孔隙率；進一步增加AB的含量時，支架制備過程中流動性變得很差，不利于支架的成型。BCP含量對支架孔隙率的影響不明顯，整體上隨著BCP含量的增加孔隙率略有下降。這與ESEM分析結果一致，即隨著致孔劑含量的增加，支架的孔徑相互連通性更好，使得支架的孔隙率更大；而BCP的含量對支架孔洞的連通性影響不大。一般而言，支架孔隙率的增大會降低支架的力學性能。

從圖5b可以看出，隨著致孔劑AB含量的增加，PLLA／BCP復合支架的壓縮強度不斷降低，未添加BCP顆粒時AB含量從1g增加到5g，支架的壓縮強度從0.78MPa降到了0.52MPa。隨著BCP含量的增加，支架材料的壓縮強度明顯提高，當AB含量為1g、BCP含量由0g增加到2g時，支架的壓縮強度從0.78MPa增加到了1.24MPa。但由于BCP與PLLA之間屬于物理共混，支架在進行發泡反應時，AB含量過高時（如5g）引起的劇烈反應會使混在PLLA中過多的BCP脫落，此時加入的BCP含量越多，支架的壓縮強度反而越低。

結合ESEM分析可知，在維持支架孔隙率不變的情況下，可以通過加入BCP提高支架的力學性能，即通過調控AB和BCP的含量可以控制支架的孔隙率和力學性能，從而滿足理想的骨支架要求。

2.5 PLLA／BCP多孔復合支架親水性能的分析

不同含量BCP制備的PLLA／BCP共混膜的接觸角見圖6。

從圖6可以看出，純的PLLA的親水性能比較差，接觸角高達（80.58±1.34）°；隨著BCP含量的增加，材料的接觸角不斷降低、親水性增加，當BCP含量為2g時，材料的接觸角為（46.50±2.19）°。這是因為，BCP陶瓷粉末中的HA含有大量的親水基團，使水溶液很容易浸潤材料的表面。支架材料需要具有一定的親水性能，以利于細胞的粘附以及營養液的吸收。

圖6 不同含量BCP制備的PLLA／BCP共混膜的接觸角Fig.6 The water contact angle of PLLA／BCP blending membranes prepared with different contents of BCP

3 結論

采用氣體發泡法制備了PLLA／BCP多孔復合支架。隨著致孔劑AB粒徑的增大，支架的孔徑尺寸相應增大；隨著AB含量的增加，PLLA／BCP多孔支架的孔隙率不斷增大，其力學性能呈下降趨勢；隨著BCP含量的增加，支架的孔隙率變化不大，但力學性能和親水性能整體上升。通過調節致孔劑AB顆粒的粒徑控制支架的孔徑尺寸，通過調節AB和BCP的含量控制支架材料的孔隙率（52.2%～82.1%）、力學性能（壓縮強度0.52～1.24MPa）以及親水性能，制備的PLLA／BCP多孔復合支架能更好地滿足骨組織工程的要求。

［1］ YOON J J，SONG S H，LEE D S，et al.Immobilization of cell adhesive RGD peptide onto the surface of highly porous biodegrada－ble polymer scaffolds fabricated by agas foaming／salt leaching method［J］.Biomaterials，2004，25（25）：5613－5620.

［2］ WEI G，MA P X.Partially nanofibrous architecture of 3Dtissue engineering scaffolds［J］.Biomaterials，2009，30（32）：6426－6434.

［3］ NIE L，CHEN D，SUO J，et al.Physicochemical characterization and biocompatibility in vitro of biphasic calcium phosphate／polyvinyl alcohol scaffolds prepared by freeze－drying method for bone tissue engineering applications［J］.Colloids Surf B Biointerfaces，2012，100：169－176.

［4］ MITTAL A，NEGI P，GARKHAL K，et al.Integration of porosity and bio－functionalization to form a 3Dscaffold：Cell culture studies and in vitro degradation［J］.Biomed Mater，2010，5（4）：045001.

［5］ NAM Y S，YOON J J，PARK T G.A novel fabrication method of macroporous biodegradable polymer scaffolds using gas foaming salt as a porogen additive［J］.Journal of Biomedical Materials Research，2000，53（1）：1－7.

［6］ CHEUNG H Y，LAU K T，LU T P，et al.A critical review on polymer－based bioengineered materials for scaffold development［J］.Composites Part B：Engineering，2007，38（3）：291－300.

［7］ CIAPETTI G，GRANCHI D，DEVESCOVI V，et al.Enhancing osteoconduction of PLLA－based nanocomposite scaffolds for bone regeneration using different biomimetic signals to MSCs［J］.Int J Mol Sci，2012，13（2）：2439－2458.

［8］ FENG J，CAI W，SUI J，et al.Poly（L－lactide）brushes on magnet－ic multiwalled carbon nanotubes by in－situ ring－opening polymerization［J］.Polymer，2008，49（23）：4989－4994.

［9］ JI C，ANNABI N，HOSSEINKHANI M，et al.Fabrication of poly－DL－lactide／polyethylene glycol scaffolds using the gas foaming technique［J］.Acta Biomater，2012，8（2）：570－578.

［10］ CURRAN J M，GALLAGHER J A，HUNT J A.The inflammatory potential of biphasic calcium phosphate granules in osteoblast／macrophage co－culture［J］.Biomaterials，2005，26（26）：5313－5320.

［11］ PARK T G.Perfusion culture of hepatocytes within galactose－derivatized biodegradable poly（lactide－co－glycolide）scaffolds prepared by gas foaming of effervescent salts［J］.Journal of Biomedical Materials Research，2002，59（1）：127－135.

［12］ NIE L，SUO J，ZOU P，et al.Preparation and properties of biphasic calcium phosphate scaffolds multiply coated with HA／PLLA nanocomposites for bone tissue engineering applications［J］.Journal of Nanomaterials，2012，2012：1－11.

［13］ MA J，WANG C，PENG K W.Electrophoretic deposition of porous hydroxyapatite scaffold［J］.Biomaterials，2003，24（20）：3505－3510.

［14］ SALERNO A，ZEPPETELLI S，DI MAIO E，et al.Processing／structure／property relationship of multi－scaled PCL and PCLHA composite scaffolds prepared via gas foaming and NaCl reverse templating［J］.Biotechnol Bioeng，2011，108（4）：963－976.