原花青素對糖尿病腎病大鼠腎臟保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

楊程，高欣，李玲，謝文利，*

（1.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，天津300162；2.武警后勤學(xué)院藥理學(xué)教研室，天津300162）

原花青素對糖尿病腎病大鼠腎臟保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

楊程1，高欣2，李玲2，謝文利2，*

（1.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，天津300162；2.武警后勤學(xué)院藥理學(xué)教研室，天津300162）

探討原花青素（Proanthocyanidin，PC）對糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激的影響以及對腎臟保護(hù)的作用。將Wistar大鼠隨機(jī)分為5組：模型組、正常對照組、原花青素低、中、高劑量組，各組灌胃給予相應(yīng)藥物，每日1次。于第21天檢測各組大鼠24 h尿蛋白（UPro）量及腎功能水平；腎皮質(zhì)丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性。PC各組腎臟指數(shù)改善明顯優(yōu)于模型組（P＜O.05），接近正常對照組水平；PC各劑量組與模型組比較Upro量、MDA含量顯著下降（P＜0.05），SOD活性顯著升高（P＜0.05）；PC高、中劑量組與模型組比較腎功能明顯改善（P＜0.05）。PC可能通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)揮對糖尿病大鼠的腎臟保護(hù)作用。

原花青素；糖尿病腎病；氧化應(yīng)激；腎功能；大鼠

糖尿病腎病（DN）已成為糖尿病嚴(yán)重微血管并發(fā)癥之一，隨著糖尿病發(fā)病率的快速增加，DN已成為終末期腎衰竭的第一病因[1]。目前認(rèn)為氧化應(yīng)激與DN密切相關(guān)，腎皮質(zhì)氧化應(yīng)激及腎小球?yàn)V過屏障足細(xì)胞損害導(dǎo)致蛋白尿在DN發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，可見抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)可有效減輕糖尿病腎損害[2]。原花青素是植物中廣泛存在的一大類多酚類化合物，PC作為天然高效的抗氧化劑，具有抗氧化應(yīng)激、保護(hù)心血管、抗腫瘤、抗過敏等眾多優(yōu)良的生物藥理學(xué)活性[3]，本實(shí)驗(yàn)旨在研究PC通過對氧化應(yīng)激的干預(yù)作用，以探討其對DN是否具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動物

雄性Wistar大鼠（180 g～200 g），SPF級：購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物合格證號：SCXK（京）2002-0003。

1.2 試劑及藥品

鏈脲佐菌素：購自Sigma公司（批號：024k1220）；尿素氮試劑盒：購自南京建成生物工程有限公司；肌酐試劑盒：購自中生北控生物科技股份有限公司，批號：080581；尿蛋白試劑盒：購自中生北控生物科技股份有限公司，批號：081105。

1.3 儀器

Bio-RAD，model-680酶標(biāo)儀；島津紫外-可見分光光度計(jì)；SHZ82型氣浴振蕩器：江蘇金壇中大儀器廠；LDZ0.8離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；AT250電子天平：瑞士METTLER公司。

1.4 大鼠糖尿病腎病模型的建立、分組及給藥

按文獻(xiàn)[4]方法，取雄性Wistar大鼠，體重180 g～200g，大鼠手術(shù)摘除右腎，一周后大鼠背部傷口愈合后，大鼠以尾靜脈注射鏈脲佐菌素50mg/kg（冰浴，pH4），誘發(fā)大鼠糖尿病。注射鏈脲佐菌素7 d后，禁食10 h，剪尾采血測定血糖。選擇空腹血糖值在11.1mmol/L以上的大鼠，確定為糖尿病模型大鼠，模型成功后3周，將所有大鼠放入代謝籠，收集尿液，采用蛋白測定試劑盒測定各組尿蛋白含量。糖尿病組大鼠尿蛋白含量（905±71）mg/L明顯高于正常對照組（89±11）mg/L，證明糖尿病腎病模型建立成功。將造模成功的大鼠再隨機(jī)分為低、中、高劑量PC組（0.5%、1%、5%）、正常對照組和模型組。每組10只。每天上午定時ig給藥1次，給藥體積10mL/kg，連續(xù)給藥21 d。

1.5 標(biāo)本收集與檢測

第21天給藥結(jié)束后，用代謝籠留取24 h尿液，記錄總量，離心，-80℃冰箱保存，以備測定24 h尿蛋白量，尾靜脈取血，按試劑盒說明書檢測尿素氮（BUN），血肌酐（SCR）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，所有動物于空腹?fàn)顟B(tài)稱體質(zhì)量，剖腹分離腎臟，用冰生理鹽水清洗，吸干水分，稱腎質(zhì)量，計(jì)算腎臟指數(shù)（腎質(zhì)量/體質(zhì)量）。分離皮髓質(zhì)，腎皮質(zhì)存于-80℃冰箱，備用。腎皮質(zhì)組織勻漿及MDA、SOD測定均按試劑盒說明書方法進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 對大鼠腎臟指數(shù)、24h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮的影響

經(jīng)21 d治療后，PC各組腎臟指數(shù)改善明顯優(yōu)于模型組（P＜0.05），接近正常對照組水平；治療21 d后，低、中、高劑量PC組24 h尿蛋白濃度顯著低于模型組（P＜0.01），且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，表明受試PC能降低DN大鼠24h尿蛋白濃度；中、高劑量PC組經(jīng)治療21 d后，血肌酐量恢復(fù)，明顯低于模型組（P＜0.05），與正常對照組無顯著性差異，表明PC有降低DN大鼠血肌酐量的作用；高劑量PC組經(jīng)過治療21 d后，血尿素氮含量降低（P＜0.05），表明PC有降低DN大鼠血尿素氮的作用，上述結(jié)果說明PC對DN大鼠腎功能具有保護(hù)作用，結(jié)果見表1。

2.2 對腎皮質(zhì)MDA含量、SOD活性的影響

灌胃給予藥物21天后，PC各劑量組與模型組比較，腎皮質(zhì)MDA含量下降（P＜0.05），同時SOD活性升高（P＜0.05），基本恢復(fù)到正常對照組水平，并且上述二項(xiàng)指標(biāo)呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。說明PC對DN大鼠腎功能的保護(hù)作用可能與氧化應(yīng)激的改善有關(guān)，結(jié)果見表2。

表1 原花青素對DN大鼠腎臟指數(shù)、血肌酐、尿素氮、尿蛋白的影響Table1 The effects of PC on renal index，SCr，urea nitrogen，urine protein in the kidney of diabetic rats

表2 原花青素對DN大鼠腎皮質(zhì)MDA含量、SOD活性的影響Table2 The effects of PC on the content of MDA and the activity of SOD in the kidney of diabetic rats

3 結(jié)論

隨著糖尿病發(fā)病率的快速增加，DN已成為終末期腎衰竭的第一病因[5]。有研究認(rèn)為，腎皮質(zhì)過氧化應(yīng)激在DN發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，因此尋找早期預(yù)防或延緩DN發(fā)生的治療方法已引起人們的高度重視[6]。糖尿病時，腎組織內(nèi)葡萄糖自動氧化，蛋白質(zhì)非酶糖化以及代謝應(yīng)激將導(dǎo)致氧化反應(yīng)產(chǎn)物（ROS）產(chǎn)生過多，破壞腎組織正常的氧化還原平衡，造成腎組織的氧化應(yīng)激狀態(tài)，此時，腎皮質(zhì)脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA含量增高，而SOD含量降低[7]。

原花青素是一種有著特殊分子結(jié)構(gòu)的生物類黃酮，是目前國際上公認(rèn)的清除人體內(nèi)自由基最有效的天然抗氧化劑，同時原花青素也是一種良好的脂質(zhì)過氧化抑制劑，具有較強(qiáng)的自由基清除和抗氧化活性。據(jù)報道[8]：原花青素是迄今為止人類所發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)、最有效的自由基清除劑之一，尤其是其體內(nèi)活性，是其他抗氧化劑不可比擬的。

本實(shí)驗(yàn)采用大鼠手術(shù)摘除右腎，單次注射STZ制備糖尿病腎病大鼠模型，觀察PC對糖尿病腎病大鼠氧化應(yīng)激腎功能的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：PC各組腎臟指數(shù)改善明顯優(yōu)于模型組（P＜0.05），接近正常對照組水平；PC各劑量組與模型組比較Upro量、MDA含量顯著下降（P＜0.05），SOD活性顯著升高（P＜0.05）；PC高、中劑量組與模型組比較腎功能明顯改善（P＜0.05），提示PC對DN大鼠腎功能具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子（如NFKB、AP-1等），減少腎小球系膜細(xì)胞（GMC）增殖及ECM積聚有關(guān)。

[1]Soo Min Nam,Mi Young Lee,Jang Hyun Koh,et al.Effects o fNADPHoxidase inhibitor on diabetic nephropathy in OLETF rats：The role ofl 11reducing oxidative stress in its protective property[J].Diabetes research and clinical practice,2009,83：176

[2]王月華,陳志強(qiáng),郭登洲,等.益氣養(yǎng)陰消瘕通絡(luò)中藥對糖尿病腎病大鼠TGF-β/Smads信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的影響[J].中草藥,2009,40 (4)：27

[3]袁敏,韓莉,裴軍軍.葡萄籽提取物原花青素藥理作用研究進(jìn)展[J].中藥材,2005,28(7)：632

[4]謝文利,萬宗明,李玲,等.原花青素-B2對體內(nèi)外蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)的影響[J].中草藥,2011,42(4)：749

[5]Renu A.Kowluru,Saiyeda N.Abbas,Sarah Odenbach.Reversal of hyperglycemia and diabetic nephropathy.Effect of reinstitution of goodmetabolic control on oxidative stress in the kidney of diabetic rats[J].Journal of Diabetes and Its Complications,2004,18：282

[6]Marchant K.Diabetes and chronic kidney disease：a complexcombination[J].Br J Nurs,2008,17(6)：356 361

[7]李龍,楊明正,周忠啟,等.阿托伐他汀對糖尿病大鼠腎臟保護(hù)作用及其機(jī)制探討[J].中國病理生理雜志,2006,22(10)：2059-2061

[8]Monagas M,Quintanilla Lopez JE,Gbmez Cordov6sa C,et al.MALDI TOFMS analysis of plant proanthocyan ns[J].J Pharm Biomed Ahal, 2010,51(2)：358-372

Protective Effects of Proanthocyanidin on Kidney of Diabetic Rats

YANG Cheng1，GAO Xin2，LI Ling2，XIE Wen-li2，*
（1.Department of Anesthesia，Affiliated Hosipital of Logistics University of People's Armed Police Force，Tianjin 300162，China；2.Department of Pharmacology，Logistics University of People's Armed Police Force，Tianjin 300309，China）

To investigate the effects of PC on oxidative stress in the kidney of diabetic rats and its protective effects on idney．Wistar rats were randomly divided into 5 groups:model group，normalcontrol group，PC low dosegroup，PC middle dose group，and PC high dose group，and were adminstered with the drug respectively.On the 21 day，24 h urine protein（U Pro），renal function，the content of MDA，and the activity of SOD were detected. Three PC dose groups，the levels of UPro and MDA were significantly decreased（P＜0.05），and the activity of SOD was significantly enhanced as compared to the model group（P＜0.05）.The renal function of PC high and middle dose groups were improved（P＜0.05）.PC can protect the kidney of diabetic rats effectively by anti-oxidative stress.

proanthocyanidin；diabetic Nephropathy；oxidative stress；renal function；rats

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.16.027

2013-10-11

楊程（1972—），男（漢），副主任醫(yī)師，碩士，主要從事麻醉臨床及實(shí)驗(yàn)研究工作。

*通信作者：謝文利（1968—），男，教授，主要從事中藥藥理研究。