木薯干旱響應基因MeHDS1的克隆與分析

于曉玲阮孟斌王樹昌彭明

（1.海南大學農學院，海口 570228；2.中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所，海口 571101）

木薯干旱響應基因MeHDS1的克隆與分析

于曉玲1，2阮孟斌2王樹昌2彭明2

（1.海南大學農學院，海口 570228；2.中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所，海口 571101）

HD-Zip是植物中所特有的轉錄因子，在植物體響應環境因子過程中起著重要的作用。以木薯cDNA為模板，利用RT-PCR技術從木薯中克隆了一個HD-Zip家族成員基因全長，命名為MeHDS1。序列分析結果表明，MeHDS1具有822個氨基酸，分子量89.07 kD，等電點為5.79，其開放閱讀框長2 469 bp，具有典型HD結構域及START結構域。該轉錄因子與棉花GL2蛋白的同源性很高，推斷其同屬第IV亞家族。MeHDS1蛋白內含有一個核定位信號，亞細胞定位試驗結果也證明，MeHDS1蛋白定位于細胞核與細胞壁中。實時熒光PCR分析表明，該基因在木薯根部表達量最高，受干旱誘導上調表達。通過對其生物信息學分析及其在木薯中表達譜分析結果表明，MeHDS1可能作為轉錄調控因子參與木薯非生物脅迫應答反應。

HD-Zip轉錄因子 木薯 表達分析 亞細胞定位

木薯（Manihot esculenta Crantz），是大戟科植物，原產于南美洲亞馬遜河盆地，一年生木本灌木，是世界上第5大糧食作物，是非洲一些國家人們生存的主要食物來源［1］。木薯最大的優點是不與其他糧食作物爭地，在其他作物無法生長的干旱地區，可以很好的生長。這一特性值得人們進行研究。抗旱相關基因的表達需經歷逆境信號的接受、轉導、誘導基因的轉錄以及功能基因的轉錄后3個不同水平的調節。在逆境條件下，逆境相關的轉錄因子能與順式作用元件結合，從而調節功能基因的表達和信號轉導，它們在轉基因植物中的過量表達會激活許多抗逆功能基因的同時表達。

HD-ZIP家族這一植物界獨有的轉錄因子，包含有單一的homeodomain（HD）［2］與一個亮氨酸拉鏈形成二聚體結構（b-zip）［3］。擬南芥中有48個成員［3，4］，蛋白參與植物器官組織的發育過程、激素

作用途徑、以及對環境條件的反應過程［5］。根據結構域的保守性、基因結構及獨特的生理功能，HDZIP可分為4個亞家族。其中，HD-Zip IV的結構與HD-Zip III相似，只是缺少一個MEKHLA結構域。這類蛋白與GL2家族相似性很高，也被命名為HDZip GL2［6］。HD-Zip IV的特征是具有TAAA core，其功能可能調控植物表皮細胞的分化［7］。科學家已經從擬南芥［5，8，9］、棉花［10］、水稻［11］、玉米［12］等不同植物中克隆得到GL2類轉錄因子，并對其功能進行了研究，但在木薯中尚未有相關研究報道。本研究從木薯中分離得到1個GL2類轉錄因子基因MeHDS1，探討該基因在不同組織中的表達差異及其對逆境脅迫的反應，并對該蛋白進行亞細胞定位鑒定，旨在為MeHDS1基因的進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

木薯華南124（SC124）由中國熱帶農業科學院木薯種質資源圃提供；煙草（Nicotiana tabacum L.）由本實驗室保存；載體pCAMBIA1300：GFP由本試驗室保存；引物合成及基因克隆測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 MeHDS1基因克隆 采用改良的Tris方法［13］提取木薯葉片與根部混合樣品總RNA，依照M-MLV reverse transcriptase試劑盒（TIANGEN）操作說明合成第一鏈cDNA。根據HD-Zip基因家族結構特點，對木薯序列數據庫（http：//www.phytozome.net/cass ava.php）中序列進行BLAST比對，獲得一個與植物中HD-Zip轉錄因子具有較高同源性的cDNA序列。利用軟件Vector NTI Advance 10設計引物：5'-TGTCGACGTGGTGAAACTT AATTTTAAG-3'（含有Sal I位點）；5'-TGGATCCCACAAAAGACCAGTTTAT-3'（含有BamH I位點），以第一鏈cDNA為摸板，通過高保真酶進行PCR擴增，PCR反應條件為：98℃10 s，55℃ 10 s，72℃ 2 min，35個 循 環；72℃5 min。PCR產物純化后連接到pMD18-T載體上，送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序，獲得的具有完整開放閱讀框的基因序列進行下面進一步的分析。

1.2.2 生物信息學分析 利用在線軟件進行生物信息學分析：（1）基因結構域分析（http：//www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）；（2）預測MeHDS1分子量及等電點：Compute pl/Mwtool，ExPASy軟件（http：//au.expasy.org/tools/pi_tool.html）；（3） 轉錄因子核定位信號預測：PSORT（http：//psort.hgc. jp/）；（4）蛋白質空間結構預測（http：//www.sbg. bio.ic.ac.uk/phyre2/）。

1.2.3 表達模式分析 待木薯SC124生長3個月（株高約1 m）后，選取長勢相近的植株進行斷水干旱處理，以正常澆水的植株作為對照處理。每個處理3盆植株，平行3次重復。12 d后，分別提取木薯SC124的根、不同位置葉片、混合葉片總RNA，經DNaseI消化后，反轉錄第一鏈cDNA。采用qPCR的方法對MeHDS1基因的表達譜進行分析。

1.2.4 植物表達載體構建 中間載體pMD18-MeHDS1和植物表達載體pCAMBIA1300：GFP質粒各約2 μg，經限制性內切酶BamH I和Sal I 37℃消化3 h后，凝膠回收目的條帶；經T4 DNA連接酶16℃連接過夜后，轉化DH5α感受態細胞。對重組質粒進行酶切、PCR鑒定，最終陽性克隆命名為pCAMBIA1300∷GFP∷MeHDS1。

將構建好的植物表達載體通過凍融法（液氮中5 min，42℃水浴5 min）轉化農桿菌LBA4404感受態細胞，在含有Rif+25 mg/L、Kan+50 mg/L和Chl+25 mg/L的YEB平板上培養，PCR鑒定為陽性的克隆，可進行后續的亞細胞定位試驗。

1.2.5 亞細胞定位 采用6 000 r/min離心10 min，收集LBA4404/P1300∷GFP∷MeHDS1（OD600為0.8）菌體，利用10 mmol/L MgCl2（+100 μmol/L AS）緩沖液重懸菌體，采用針筒注射的方法，注射煙草葉片背面細胞，共培養72 h后，采用共聚焦顯微鏡觀察，拍照分析。

2 結果

2.1 MeHDS1基因克隆與序列分析

國家以改善孤殘兒童成長環境、提高孤殘兒童生活質量為目標，提出“十一五”[1]和“十二五”兒童福利機構建設藍天計劃暨兒童福利機構設備配置實施方案[2]（以下簡稱“藍天計劃”）。切實加強兒童福利機構基礎設施建設，保障孤殘兒童的集中養護、救治、教育和康復。

通過RT-PCR方法獲得一個來源于木薯SC124品種的，具有完整開放閱讀框（open reading frame，ORF），長2 469 bp的基因序列。該基因序列經過結構域分析（圖1）發現其包含一個HD 結構域（長

59個氨基酸）、一個START結構域（長229個氨基酸）及一個LZ區域。NCBI數據庫BLAST-p結果表明，該序列與葡萄HD-Zip基因（GenBank序列號為XP_002272264）具有很高的同源性（93%）。

圖1 MeHDS1氨基酸序列（A）及蛋白保守結構域（B）分析

序列分析表明：MeHDS1基因編碼822個氨基酸，預測其分子量為89.07 kD，等電點為5.79。在基因內發現一個核定位信號（P113-PRKKRYH），符合轉錄因子細胞區室定位特征；通過對MeHDS1蛋白的空間結構預測分析發現其具有3個螺旋結構（圖2）。

圖2 MeHDS1蛋白空間結構預測

BLAST-p分析結果表明，MeHDS1蛋白與棉花GL2蛋白的同源性很高，因此推測其可能屬于HD-Zip IV亞家族成員。將MeHDS1氨基酸序列與GenBank中已登錄的、已知功能的擬南芥HD-Zip IV亞家族成員進行序列比對，并構建系統進化樹，進行系統發育分析。結果（圖3）顯示，MeHDS1與GL2基因同源性最高，因此進一步推斷MeHDS1可能是HD-Zip IV亞家族GL2類轉錄因子。

圖3 MeHDS1與其他物種已知為HD-Zip IV家族系統進化樹分析

2.2 表達模式分析

選取生長3個月，長勢均勻的木薯SC124，進行干旱處理，干旱12 d后，提取葉片、葉柄和根的總RNA，反轉錄合成第一鏈cDNA。針對基因區特異性片段設計引物，采用Real-time PCR手段分析MeHDS1基因在木薯不同組織中的表達模式，結果（圖4-A）顯示：干旱處理12 d的木薯不同組織中，MeHDS1基因的表達量存在差異，在葉中的表達量明顯高于根中；干旱處理后，MeHDS1基因在根與葉片組織中的表達量都有不同程度的增加，但增加的幅度在根中較葉片中要大。

圖4 q-PCR分析MeHDS1基因表達模式

2.3 植物表達載體構建

利用帶有酶切位點的引物進行PCR擴增，得到2 469 bp的MeHDS1基因的cDNA編碼序列，條帶單一，回收后送往測序，驗證序列為正確序列。將目的片段純化后，用限制性內切酶BamH I和Sal I酶切（圖5-A），回收目標片段（圖5-A-MeHDS1箭頭所示）；同時，將pCAMBIA1300∷GFP用限制性內切酶BamH I和Sal I酶切（圖5-A），回收回收目標大片段（圖5-A-1300箭頭所示）；將MeHDS1目標片段與pCAMBIA1300∷GFP大片段利用T4 DNA連接酶進行連接后，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，于帶有Kan+抗性的LB平板上篩選陽性克隆。將PCR/酶切鑒定為陽性的克隆質粒（圖5-B）進行測序，結果表明序列是正確的，無移碼突變，命名為pCAMBIA1300∷MeHDS1∷GFP。采用凍融法將pCAMBIA1300∷MeHDS1∷GFP質粒轉入農桿菌LBA4404菌株，用于后續功能分析。

圖5 限制性雙酶切圖

2.4 亞細胞定位

本試驗將構建好的帶有1300∷GFP∷MeHDS1表達框的植物表達載體，轉化農桿菌LBA4404。采用注射方法轉化煙草葉片，共培養72 h。將共培養后的葉片經20%甘油處理后，進行壓片，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。熒光分析結果（圖6）表明：融合了GFP的MeHDS1蛋白在煙草葉片細胞的細胞

壁及核內表達，初步表明MeHDS1蛋白定位于細胞核內和細胞壁上。

圖6 MeHDS1蛋白的亞細胞定位

3 討論

木薯屬于典型的抗旱、耐貧瘠作物［14］。我國南方地區，在其他作物無法生長的邊緣地帶都可以見到它們的身影，其作用機理尚無確切的報道。針對木薯抗旱基因的克隆及抗逆作用機理的研究，無論是對其他作物的遺傳改良還是自身品種改良都具有尤為重要的作用。

本研究自SC124木薯品種中克隆得到一個干旱脅迫下差異表達基因的MeHDS1。生物信息學分析結果顯示，該蛋白具有一個核定位信號；基因的亞細胞定位試驗結果表明MeHDS1在核及細胞壁中得到表達，因此推測，MeHDS1可能是一種轉錄因子。轉錄因子是細胞中重要的調節機制［15］，目前得到的HD-Zip家族成員多是定位于細胞核中［16］。

MeHDS1蛋白空間結構預測表明，該蛋白具有1個保守的HD結構域、1個LZ區域、1個START結構域（Steroidogenic acute regulatory protein-related lipid transfer）。因此，初步推斷該基因應該屬于HDZip家族中的一員；空間結構分析顯示MeHDS1蛋白具有典型的3個螺旋結構，HD-zip家族多是該結構［5］。另外，通過BLAST分析得知，MeHDS1蛋白與棉花GL2、小麥TaGL9及擬南芥AtGL2都具有很高的同源性。因此，我們推斷MeHDS1蛋白可能屬于HD-Zip IV亞家族。

HD-Zip IV這類蛋白與GL2家族相似性很高，也被命名為HD-Zip GL2［6］，它的特征是具有TAAA core，其功能可能調控植物表皮細胞的分化［7］。干旱脅迫下，木薯根系中MeHDS1蛋白表達顯著升高，我們推測干旱脅迫下該蛋白可能參與根細胞分化的調節，具體作用機制有待進一步研究。

4 結論

本研究基于木薯SC124 cDNA，利用RTPCR技術成功克隆獲得1個HD-Zip家族成員基因MeHDS1。序列分析表明，其編碼822個氨基酸，分子量89.07 kD，等電點為5.79，其開放閱讀框長2 469 bp，具有典型HD結構域及START結構域。系統進化樹分析結果表明，其與棉花GL2蛋白的同源性很高，推斷其同屬第IV亞家族。生物信息學分析表明MeHDS1蛋白內含有一個核定位信號，通過亞細胞定位試驗證明了此推斷，該蛋白在細胞核中優勢表達。實時熒光定量PCR分析結果表明：MeHDS1基因在葉片中的表達量比根部高；干旱脅迫可不同程度提高該基因的表達，且MeHDS1基因在根部表達量升高的幅度較葉片組織增幅要大；干旱脅迫條件下，木薯植株頂端功能葉中MeHDS1基因的表達量顯著高于底部葉片。將MeHDS1基因構建了植物過量表達載體，并成功在煙草葉片中實現表達。

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（責任編輯 狄艷紅）

Cloning and Functional Analysis of MeHDS1 from Cassava Responsing Drought

Yu Xiaoling1，2Ruan Mengbin2Wang Shuchang1，2Peng Ming2
（1. College of Agriculture，Hainan University，Haikou 570228；2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，CATAS，Haikou 571101）

The HD-Zip transcription factors are unique to the plant kingdom. They play important roles in plant responsing to the environmental factors. Based on the cDNA of cassava, using RT-PCR technology, one gene sequence was obtained, named it as MeHDS1. The sequence was analyzed, we got a 2 469 bp gene which have integrated ORF, MeHDS1 encoded a protein which contained 822 amino acids（89.07 kD）with an isoelectric point of 5.79. MeHDS1 have typical HD-domain, START domain. It has high homology to GL2 gene of cotton and Arabidopsis, so it might belong to HD-Zip IV subfamily. There have a nuclear localization signal in MeHDS1 protein, and which was localized in the nucleus and cell wall by subcellular localization assay in tobacco epidermal cells. Real-time PCR results showed that, MeHDS1 was upregulated under drought, and its variation of expression was more highly in root cells than that in leaves cells. Through its bioinformatics and expression analysis, we concluded that MeHDS1 may be involved in cassava abiotic stress responsed as a transcription factor.

HD-Zip transcription factor Cassava Expression analysis Subcellular localization

2014-02-28

國家重點基礎研究發展計劃（2010CB126601），海南省重大科技專項（ZDZX2013023-1-10）

于曉玲，女，博士研究生，副研究員，研究方向：農業生物技術；E-mail：lingdang01@126.com

彭明，男，博士，研究員，研究方向：植物遺傳學；E-mail：mmpeng_2000@yahoo.com