昆蟲包涵體衍生型病毒經口感染相關蛋白的研究進展

相興偉 周宇芳

（浙江省海洋開發研究院，舟山 316000）

昆蟲包涵體衍生型病毒經口感染相關蛋白的研究進展

相興偉 周宇芳

（浙江省海洋開發研究院，舟山 316000）

了解昆蟲桿狀病毒包涵體衍生型病毒（Occlusion-derived virus，ODV）的經口感染相關蛋白對揭示桿狀病毒建立原發感染的機制、明確昆蟲的先天免疫系統，以及研究控制昆蟲新策略等方面具有重要意義。目前已鑒定的經口感染因子（Per os infectivity factors，PIF）包括P74、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF5（ODV-E56）和PIF6。此外，與ODV病毒粒子經口感染有關的蛋白有ODV-E66、VP91、Ac108、ORF 145和ORF 150。綜述近年來關于上述經口感染相關蛋白的結構和功能等研究成果，分析了這些蛋白的分子生物學特征。

桿狀病毒 包涵體衍生型病毒 經口感染 分子特征

桿狀病毒是一類專一性感染節肢動物的病原微生物，在感染周期中產生兩種表型不同但遺傳物質完全一樣的病毒形態，即出芽型病毒（Budded virus，BV）和包涵體衍生型病毒（Occlusion-derived virus，ODV）。BV在病毒感染早期大量產生，負責組織間的水平傳播。而在病毒感染晚期，數以千計的ODV被裝配包埋入由多角體蛋白組成的包涵體（Occlusion body，OB）中，該類型病毒負責代與代間的垂直傳播。目前對BV的研究比較深入，而對ODV的研究相對較少。ODV病毒粒子借其表面的囊膜蛋白與中腸柱狀上皮細胞的微絨毛表面受體結合，通過膜融合使病毒核衣殼進入中腸上皮細胞內而啟動原發感染。因此，ODV病毒粒子囊膜上含有決定宿主范圍和啟動原發感染的蛋白質因子，這些蛋白因子被稱為經口感染因子（Per os infectivity factors，PIF）。近年來，隨著多種桿狀病毒基因組測序的完成，越來越多的經口感染相關蛋白得到鑒定（圖 1）。目前確定的pif基因有p74、pif-1（orf119）、pif-2（orf22）、pif-3（orf115）、pif-4（orf96）、pif-5（odv-e56）和pif-6（orf68）、而 ORF 145、ORF 150、VP91、ODV-E66和 Ac108與經口感染有關。下面以桿狀病毒的模式代表種苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrov-irus，AcMNPV）為例，對桿狀病毒中與經口感染相關的蛋白進行綜述。

圖1 經口感染相關蛋白

1 經口感染因子

1.1 P74

p74基 因（ORF 138，119 135-121 072 nt）長1 938 bp，編碼的分子量74 kD由645個氨基酸殘基組成P74。P74是第一個被鑒定到的與經口感染相關的ODV囊膜蛋白，按照發現時間可以把P74看作是PIF-0［1，2］。在所有已測序的桿狀病毒中都存在P74及其同源物，而且在Nudiviruses病毒［3］，唾液腺肥大病毒（Salivary gland hypertrophy viruses，SGHVs）［4］和寄生蜂多分病毒（Polydnaviruses）［5］中也存在其同源物。P74蛋白的羧基端存在一個高度疏水的跨膜序列，該序列使P74定位于ODV囊膜上［6，7］。Haas-Stapleton等［8］證實P74能介導ODV與中腸上皮細胞表面的特殊受體相結合；與野生型病毒相比，缺失P74的突變病毒的經口感染力下降了105倍，而結合到中腸上皮細胞的ODV數量僅僅降低了3倍，表明ODV與中腸上皮細胞的結合并不能確保原發感染。研究表明P74以飽和方式與柱狀上皮細胞的刷狀緣基底膜囊泡（Brush border membrane vesicles，BBMV）相互結合，從棉鈴蟲中腸的BBMV中鑒定到一個30 kD的潛在受體蛋白，而在甜菜夜蛾中腸的BBMV中篩選到一個35 kD的蛋白［2，9］。Slack等［10］研究發現在中腸強堿性環境下，P74經胰蛋白酶裂解才能發揮其經口感染作用。該研究小組近期證實缺失C端高度疏水跨膜域的P74仍然具有經口感染的能力，而且能夠功能性地修復敲除p74的重組病毒［11］。最近研究人員發現，在ODV從包涵體釋放過程中，P74首先被包涵體內的內源性堿性蛋白酶迅速酶解為兩段，再被胰蛋白酶裂解N端，表明P74在發揮作用的過程中經歷了兩次酶解過程［12］。Wang等［13］將p74、p10和p26一起敲除，觀察到形成的多角體未包涵病毒粒子，推測P74可能與ODV的成熟以及隨后的包埋有關。最近研究證實，PIF-1、PIF-2與PIF-3在ODV病毒粒子表面形成一個穩定的復合體，而P74與復合體有關，但敲除p74并不影響復合體的形成［14，15］。在BV表面展示P74并不能增強BV的經口感染能力［16］。

1.2 PIF-1

pif-1基因（ORF 119，100 699-102 291 nt）長1 593 bp，編碼分子量60 kD的由530個氨基酸殘基組成的PIF-1。首次在灰翅夜蛾核型多角體病毒（Spodoptera littoralis Nucleopolyhedrovirus，SpliNPV）中鑒定到PIF-1蛋白是ODV囊膜蛋白［17］。像P74蛋白一樣，PIF-1也是高度保守的，存在于所有已經測序的桿狀病毒中，而且在Nudiviruses病毒中也存在PIF-1的同源物［3］。敲除該基因不影響病毒在培養細胞中的毒力，卻使重組病毒喪失了經口感染昆蟲幼蟲的能力，而且PIF-1也參與介導了ODV與昆蟲中腸柱狀上皮細胞表面的特異性受體的識別與結合的過程［18］。Peng等［14，15］發現PIF-1、PIF-2和PIF-3在ODV病毒粒子的表面形成一個穩定的復合體，敲除pif-1后復合體將不再形成。

1.3 PIF-2

pif-2基因（ORF 22，17 301-18 449 nt）長1 149 bp，編碼分子量44 kD的由382個氨基酸殘基組成的PIF-2。PIF-2在目前已測序的桿狀病毒基因組中高度保守，在Nudiviruses病毒中也存在其同源物［19］。在PIF-2的 N端存在一段高度疏水的跨膜域，PIF-2特異性地分布在ODV囊膜的表面［6，15］。分別在甜菜夜蛾核型多角體病毒（Spodoptera exigua multiple nucleopolyhedrovirus，SeMNPV）和棉鈴蟲核型多角體 病 毒（Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus，HearNPV）中敲除pif-2，都觀察到經口感染能力顯著降低［20，21］。與P74和PIF-1相似，缺失PIF2不影響BV的感染能力，卻影響經口感染能力，且PIF2也參與介導昆蟲中腸上皮細胞與ODV結合的

過程［18］。如前所述，PIF-2是經口感染因子復合體的組分，敲除pif-2不會形成復合體［14，15］。

1.4 PIF-3

pif-3基因（ORF 115，99 182-99 796 nt）長615 bp，編碼分子量23 kD的由204個氨基酸殘基組成的PIF-3。與前面介紹的經口感染因子相似，PIF-3在已測序的桿狀病毒基因組中也是高度保守的，也存在于Nudiviruses病毒中［22］。在PIF-3的N端也存在一段高度疏水的跨膜域，而且研究人員已證實PIF-3特異性地定位于ODV囊膜［18］。Ohkawa等［18］研究發現PIF-3也是經口感染必需的，卻不參與介導ODV與中腸上皮細胞的結合和融合的過程，推測PIF-3可能在原發感染的過程起到一種未知但關鍵的作用。最近報道PIF-3是經口感染因子復合體的必備組分，很好地解釋了PIF-3為何也是經口感染必須的［14，15］。

1.5 PIF-4

pif-4基因（ORF 96，84 346-84 867 nt）長522 bp，編碼分子量28 kD的由173個氨基酸殘基組成的PIF-4。PIF-4也是高度保守的，存在于目前已經測序的所有桿狀病毒和Nudiviruses病毒中［22］。研究發現PIF-4在家蠶BmNPV中的同源物ORF 79分布在ODV囊膜上［23］，而在AcMNPV中不僅存在于ODV囊膜上，也存在于BV的囊膜上［24］，最近發現PIF-4特異性的存在于HearNPV的ODV囊膜上［6］。在AcMNPV中敲除該基因發現，不影響BV的感染能力和多角體的形成，卻使重組病毒喪失了經口感染能力［24］。PIF-4也是經口感染因子復合體的組分，而且與PIF-1、PIF-2和PIF-3形成一個穩定的復合體，敲除pif-4后影響了穩定復合體的形成［14］。棉鈴蟲核型多角體病毒（HearNPV）的ORF85是PIF-4的同源物，研究發現缺失ha85導致復合體不能正常形成，而且酵母雙雜交證實HA85與P74、PIF-1、PIF-2和 PIF-3存在相互作用［25］。我們在BmNPV中敲除Bm79使得重組病毒喪失感染對幼蟲的經口感染能力，雙分子熒光蛋白互補和免疫共沉淀表明Bm79與PIF1、PIF2、PIF3和ODV-E66存在相互作用。

1.6 PIF-5（ODV-E56）

pif-5基因（ORF 148，129 008-130 138 nt）長1 131 bp，編碼分子量41 kD 的由376個氨基酸殘基組成的PIF-5，也稱為ODV-E56。ODV-E56是高度保守的，其同源物存在于所有已公布的桿狀病毒和Nudiviruses病毒中［22］。在AcMNPV、HearNPV、CuniNPV、ChchNPV和PrGV的ODV的蛋白質組中都發現了ODV-E56及其同源物［26-30］，令人疑惑的是在AcMNPV的BV的蛋白質組中也鑒定到了該蛋白［31］，系統分析HearNPV的BV和ODV發現ODV-E56特異性地存在于ODV囊膜上［6］。ODV-E56是種屬特異性因子，能決定宿主范圍［32］。先前的研究表明，將LacZ插入替換其中的139個氨基酸不會影響病毒的毒力［33］。而最近的一些研究表明缺失ODV-E56 雖不影響BV的感染力，卻與經口感染相關［34］，本實驗室在這方面也做了相關工作［35］，而且茶刺蛾核型多角體病毒（Rachiplusia ou multiple nucleopolyhedrovirus，RoMNPV）的ODV-E56可以功能性地修復缺失ODV-E56的AcMNPV［36］。與PIF-3類似，ODV-E56也不參與介導ODV與中腸上皮細胞的結合和融合的過程［34］。在研究經口感染因子復合體的過程中，發現ODV-E56并不是復合體的組分［14］，而酵母雙雜交證明ODV-E56可與38K和PIF-3發生相互作用［15］，推測ODV-E56可能在原發感染的過程中通過與經口感染因子復合體的組分互作而發揮作用。

1.7 PIF-6

pif-6基 因（ORF68，129 008-130 138 nt） 長579 bp，編碼分子量22.3 kD的由192個氨基酸殘基組成的PIF-6。PIF-6也是高度保守的，存在于所有的已測序的桿狀病毒中。BmNPV ORF 56是其同源物，在研究Bm56的過程中，發現其定位于ODV的核衣殼上，在BV和ODV的囊膜上都不存在，與其他經口感染因子的定位明顯不同［37］。而在研究AcMNPV的Ac68時發現其在BV和ODV上都有分布［38］，蛋白質組學鑒定到PIF-6的同源物存在于HearNPV的ODV囊膜上［6］。在BmNPV中敲除bm56，對BV的毒力無影響，卻延長了幼蟲的致死時間，而且影響多角體的形態［37］。先前研究發現當AcMNPV缺失ac68時，對BV的感染力、核衣殼結構和包涵體形態都無影響，卻延長了致死時間［39］。

近期研究人員發現Ac68與經口感染相關，將其命名為PIF-6［38］。巧合的是，在分析經口感染因子復合體的組分時，預測Ac68可能是其中的一種組分，目前尚缺少試驗數據證實［14］。

2 經口感染相關蛋白

2.1 ODV-E66

odv-e66基因（ORF 46，36 718-38 832 nt）長2 115 bp，編碼分子量66 kD的由704個氨基酸殘基組成的ODV-E66。在研究ODV-E66的過程中證實ODV囊膜蛋白存在于病毒誘導的核內微泡中［40］。ODV-E66在鱗翅目桿狀病毒中高度保守，其N端也存在一個高度疏水域［41］。ODV-E66特異性地定位于ODV囊膜上，在BV中不存在［6］。之前對ODV-E66的研究主要集中在N端的跨膜域上，將其與EGFP融合表達時可傳遞融合蛋白至核內膜和ODV囊膜［41］。研究人員發現在缺失FP25K的條件下，ODV-E66轉運到病毒誘導的核內囊泡的數量明顯減少［42］。共價交聯試驗進一步證實FP25K直接參與ODV-E66至核膜的傳送過程［43］。本實驗室成功構建了敲除odv-e66的突變病毒，發現缺失ODV-E66不影響病毒的感染力和核衣殼的組裝，卻影響病毒的經口感染能力［44］。分析鑒定經口感染因子復合體的組分時，發現其并非復合體的組成成分［14］。酵母雙雜交試驗表明ODV-E66與PIF-2和PIF-3相互作用，表明ODV-E66雖不是經口感染因子復合體的組分，卻與復合體的組分相互作用，從而在經口感染的過程中發揮作用［45］。ODV-E66與肺炎鏈球菌的透明質酸酶具有很高的相似度，可能是一種透明質酸酶，在原發感染過程中有助于穿透細胞外基質［46］。最近研究報道，在桿狀病毒感染的昆蟲細胞培養基中發現一種新型的軟骨素酶，經鑒定其是截短的ODV-E66，其具體生物學機制有待進一步闡述［47］。

2.2 ORF 145和ORF 150

ORF 145和ORF 150彼此相關，這兩個蛋白的氨基酸序列具有23%的同源性，而且與棉鈴蟲痘病毒的11 kD蛋白相關。ac145存在于大部分已測序的桿狀病毒中，除雙翅目核型多角體病毒外；而ac150僅存在于與AcMNPV親緣關系較近的鱗翅目核型多角體病毒中。Ac145和Ac150存在一個與幾丁質結合的功能域［48］，而且Ac145在HearNPV中同源物被證實可與幾丁質結合［49］。研究人員證實Ac145和Ac150在BV和ODV的囊膜中都能檢測到，單獨敲除ac145使得對粉紋夜蛾的感染力下降6倍，對煙蚜夜蛾卻無影響，單獨敲除ac150無影響，將2個基因一起刪除導致對煙蚜夜蛾的感染能力下降39倍［50］。通過血淋巴注射和經口感染的對比試驗來研究野生型和敲除ac150的突變病毒的毒力差別，結果在煙蚜夜蛾、斜紋夜蛾和粉紋夜蛾的幼蟲中重組病毒的經口感染能力明顯降低［51］。在BmNPV中敲除ac150的同源物bm126，發現經口感染能力無明顯差別，而致死時間有一定程度的延長［52］。因此，Ac145和Ac150也被分類為PIF因子，與其他PIF因子不同，它們起介導作用卻不是經口感染必需的。

2.3 VP91

vp91基因（ORF 83，67 884-70 427 nt）長3 543 bp，編碼分子量91 kD的由1 180個氨基酸殘基組成的VP91。在OpMNPV中首次鑒定到了VP91，其并不是特異性地存在于ODV囊膜上，在BV中也存在［53］。VP91在核膜區域積累，分布于病毒感染的細胞核中，免疫電鏡觀察到VP91存在于ODV的囊膜和衣殼中［53］。VP91高度保守，在所有桿狀病毒和Nudiviruses病毒中都有存在［22］。在許多桿狀病毒的ODV中都檢測到了VP91及其同源物［6，26-30］，在AcMNPV和HearNPV的BV的蛋白質組學中卻未鑒定到VP91及其同源物［6，29］。在分析經口感染因子復合體的組成成分時發現，其是經口感染因子復合體的成分［14］。本實驗室在BmNPV中敲除該基因的同源物發現，其影響BV的產生，而且與核衣殼的成熟以及隨后病毒粒子包埋進入包涵體的過程相關。這些結果表明BmP95對BV的產生、核衣殼的精確組裝，以及ODV的成熟是必需的［54］。目前沒有相關試驗數據表明P95與經口感染相關，因為敲除該基因影響了BV的形成，不能獲得缺失BmP95的子代病毒粒子，因而無法進行相關的生物學試驗驗證其經口感染特性。最近，研究人員在AcMNPV中敲除該基因的幾丁質結合域，導致重組病毒的經口感染能力顯著降低，暗示了該蛋白的幾丁質結合域可能在ODV病毒粒子與圍食膜或者其他含有幾丁質的

組織相互結合的過程中起作用［55］。

2.4 Ac108

ac108基因（ORF 108，94 392-94 709 nt）長318 bp，編碼分子量11 kD的由105個氨基酸殘基組成的Ac108。Ac108在鱗翅目桿狀病毒中高度保守，其同系物出現在所有I型NPV、II型NPV和GV（除PlxyGV）中。在HearNPV和柞蠶核型多角體病毒（Antheraea pernyi nucleopolyhedrovirus，AnpeNPV）的ODV中檢測到Ac108的同系物，表明該蛋白為一ODV蛋白［6，56］。斜紋夜蛾核型多角體病毒（Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrovirus，SfMNPV）ORF 58是其同源物，利用λ-red同源重組系統構建敲除sf58的重組病毒，經口感染試驗表明，敲除型病毒的多角體不能感染斜紋夜蛾的幼蟲，而修復型病毒與野生型病毒的多角體可感染其幼蟲，表明Sf58是僅存在于鱗翅目桿狀病毒中的一種新鑒定的經口感染因子［57］。Ac108在BmNPV中的同源物是Bm91，在BmNPV中敲除bm91其不影響BmNPV的毒力，使得幼蟲的致死時間延長［58］。本實驗室研究Bm91發現，其特異性地定位于ODV囊膜，而生物學試驗與Tang等［58］研究存在一定差異（未發表數據）。研究人員通過蛋白質組學研究經口感染因子復合體的組成成分時，預測Ac108可能是經口感染因子復合體的組分［14］。

3 結語

目前，對桿狀病毒與昆蟲中腸之間的生物化學和物理方面的相互作用探索較少，而這方面的知識是發展新的基因方法控制農業害蟲的理論基礎。因此，了解ODV經口感染相關蛋白能為控制有害昆蟲提供干預策略，而且闡明這些科學問題將有助于揭示桿狀病毒的入侵機制及規律，并為設計相對廣譜的抗病毒入侵藥物提供新思路。同時，作為桿狀病毒原發感染的場所，幼蟲中腸也能合成許多特異性表達的抗病毒蛋白，但是目前尚不清楚其抗病毒機理。因此，從宿主中腸組織中篩選與經口感染相關蛋白互作的蛋白質，有可能找到抑制病毒感染的宿主蛋白，拓展桿狀病毒的生物防治和應用。

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（責任編輯 狄艷紅）

Research Progress of Proteins Associated with Per os Infectivity of the Occlusion-derived Virus

Xiang Xingwei Zhou Yufang
（Zhejiang Marine Development Research Institute，Zhoushan 316000）

The study of baculovirus proteins associated with per os infectivity is of great importance not only for viral biology but also for the fact that these proteins expose vulnerabilities in the insect immune system and this knowledge is also fundamental for the development of new strategies for insect control. Recent researches show that the proteins associated with per os infectivity of the occlusion-derived virus（ODV）include P74, PIF1, PIF2, PIF3, PIF4, PIF5（ODV-E56）, PIF6, ODV-E66, VP91, Ac108, ORF 145 and ORF 150. This paper reviewed recent research achievements about the structure and function of the proteins and analyzed the molecular biology characteristics of these proteins.

Baculovirus Occlusion-derived virus Per os infectivity factors Molecular characteristics.

2014-03-27

國家科技支撐項目（2012BAD29B06），浙江省自然科學基金項目（LQ14C170001）

相興偉，男，博士，研究方向：分子生物學及其基因工程利用；E-mail：xxw11086@126.com