低溫秸稈降解微生物菌劑的研究進展

趙旭 王文麗 李娟 呼和

（甘肅省農業科學院土壤肥料與節水農業研究所，蘭州 730070）

低溫秸稈降解微生物菌劑的研究進展

趙旭 王文麗 李娟 呼和

（甘肅省農業科學院土壤肥料與節水農業研究所，蘭州 730070）

秸稈的成分主要有纖維素、半纖維素和木質素等，降解秸稈的微生物包括細菌、放線菌和真菌。低溫秸稈降解微生物的選育方法有直接從自然界中篩選、誘變育種、原生質體融合育種、基因工程育種等。目前，篩選獲得的低溫秸稈降解菌株的數量有限，降解秸稈的能力不高，低溫條件下菌株的降解機理都需要進一步的研究。綜述了低溫條件下秸稈降解微生物菌劑的研究進展。

低溫降解 作物秸稈 微生物 秸稈還田

農作物秸稈是自然界中豐富的可再生資源［1］，截至2009年，我國農作物秸稈可收集資源量達到6.87×108t，理論資源量達到8.20×108t，約占世界秸稈總量的20%-30%。秸稈的類型主要有水稻秸稈、小麥秸稈、玉米秸稈、雜糧秸稈、薯類秸稈、豆類秸稈、棉花秸稈、油菜秸稈和花生秸稈等，其中玉米秸稈占35%，小麥秸稈占21%，稻草占19%［2］，三大作物秸稈占秸稈總量的75%，其他作物秸稈占25%［3］。但由于作物秸稈不能在短時間內被腐解利用，大部分秸稈被直接焚燒，不僅造成資源的浪費，還污染了環境。近年來，為了充分利用秸稈，經過不斷的研究開發，形成了秸稈還田作肥料；秸稈氣化、熱解發電；秸稈粉碎配比作食用菌基料；秸稈青貯、氨化、鹽化作飼料；秸稈加工成型或做編織原料等5條利用途徑［4］。隨著農業技術的迅猛發展，秸稈還田越來越受到重視。作物秸稈原位還田，不僅可以提高秸稈的綜合利用率，而且可以提高土壤肥力、培肥改土。然而我國北方秋冬季節氣溫低、冰期長、凍土層厚、氣候干旱冷涼，秸稈進入土壤后，腐解緩慢，還田幾個月后秸稈變化不大。由于不能及時腐解，大量秸稈還田后影響農田土壤整地和作物的播種，使一些病蟲和病原菌在土壤中長時間存活，給作物生長帶來嚴重的危害。如果還田秸稈的大部分在短時間內腐解，不僅不會影響作物的生根及成活，而且還能提高產量，推廣的意義非常重大。為了提高秸稈降解效率，科學家們對秸稈降解微生物

菌劑進行了大量研究，并獲得了多種降解秸稈纖維素、木質素的菌株，但目前研究獲得的菌株都存在酶活低、穩定性差、易退化、特別是耐冷性弱等問題，并未顯著提高還田效果，因而選育耐低溫高效降解秸稈的菌株對進一步有效利用農作物秸稈具有非常重要的意義。本文系統闡述了國內外有關低溫秸稈降解微生物的研究進展，并展望了今后的發展趨勢。

1 秸稈的主要成分及自然降解過程

1.1 秸稈的主要成分

作物秸稈分莖和葉兩部分，秸稈表面有一層非常致密的角質蠟狀膜，這種膜由脂溶性的脂肪醇、脂肪酸、烷烴、酮類、醛類和酯類等有機分子組成［5］。秸稈表面光滑，蠟質層中含有的SiO2和低聚物能防止秸稈在生長過程中水分過度蒸發和病菌的侵入，但表面蠟質層也影響了微生物降解秸稈的速率。秸稈的干物質一般由灰分和含氮化合物與非含氮化合物組成。含氮化合物包括蛋白質和其他含氮物；非含氮化合物包括纖維素、半纖維素和木質素等。其中非含氮化合物約占秸稈干重80%。水稻、小麥及玉米等農作物秸稈的纖維素含量約為30%-35%，半纖維素含量約為25%-30%，木質素含量約為20%-25%［6］。秸稈的碳氮比很高，而微生物生長對C/N值的要求在30左右，所以秸稈在自然腐解過程中將與作物爭奪無機氮，腐解效率低，影響作物的生長。纖維素類物質是植物細胞壁的主要成分，它包括纖維素、半纖維素和三維網狀結構的木質素等［7］。纖維素是葡萄糖以β-1，4糖苷鍵結合形成的直鏈高分子化合物，分子式為：（C6H10O5）n，含碳 44.44%、氫6.17%、氧49.39%［8］。纖維素分子主要由結晶區（Crystalline）和非結晶區（Amorphism）兩部分組成，結晶度一般在30%-80%之間，結晶區分子鏈內、鏈間及分子鏈與表面分子之間形成的氫鍵，使纖維素分子結構穩定難以被降解，非結晶區纖維素結構比較疏松，容易被微生物降解利用［9，10］。常溫條件下，纖維素既不溶于乙醇和乙醚等有機溶劑，也不溶于稀堿溶液。Petersson 等［11］研究發現纖維素分子間以及分子內存在大量的氫鍵，這給纖維素水解帶來很大的困難。雖然稀酸不能水解纖維素，但稀酸或纖維素酶等可滲入纖維結晶區使纖維素生成D-葡萄糖、寡糖和纖維二糖。

1.2 秸稈的自然降解過程

作物秸稈的纖維素、半纖維素以及木質素的降解機理各不相同，因而其降解微生物也存在差異。纖維素的降解是通過內切型葡聚糖酶（Cx酶）、外切型葡聚糖酶（C1酶）和β-葡萄糖苷酶（Cb酶）等協同作用實現的［12］。纖維素是通過酶的纖維素結合結構域與酶分子連接的，然后利用催化結構水解纖維素。研究者一般只研究其中部分酶的活性，沒有全面了解菌株的降解酶系，存在酶組分比例不協調等問題［13］。降解纖維素的菌株主要有芽孢桿菌類細菌、放線菌以及木霉等。尹礎等［14］以纖維素為唯一碳源篩選獲得一株具有秸稈降解功能的熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens），并研究了其產酶能力。木質素的降解機制非常復雜，主要有3種酶系組成：木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶。參與降解木質素的微生物有細菌、真菌及相關微生物菌群，降解的菌株主要有白腐真菌［15］。秸稈的自然降解需要多種酶系在適宜的條件下協同作用，單菌株由于不能分泌健全的降解酶系，很難達到對秸稈的完全降解［12］。宋亞彬等［16］研究了木質纖維素降解復合菌系的培養條件，確定了最佳培養碳源、氮源、pH、溫度等。史玉英等［17］研究發現纖維素分解菌與木質素分解菌對稻草的聯合分解能力明顯高于單一菌株，所以秸稈降解菌劑的研究逐漸由單菌種的篩選轉變為菌群的篩選。

2 秸稈降解微生物的種類

微生物的生命特征多種多樣，生活方式豐富多彩，與自然界中的其他生物相互作用，適應不同的生態環境，代謝方式和生理功能千差萬別。利用秸稈降解微生物菌劑處理秸桿，在適宜的溫度和濕度條件下將秸稈中的有機物質礦化、腐殖化，使秸桿中的有機物、微量元素以及速效N、P、K回歸到土壤中，提高土壤肥力，改善土壤結構，增加作物產量。秸稈降解不同階段發揮主要作用的微生物各不相同，第一階段主要是細菌利用秸稈中的可溶性物質生長繁殖，腐殖質開始積累；第二階段主要是真菌降解木質素，此階段大量積累腐殖質；第三階段主要是放線菌分解腐殖質的過程。

細菌和真菌主要參加木質素的降解，首先是真菌對木質素進行礦化，然后細菌利用其體積小、營養物質吸收面大、物質交換快等特點，切斷木質素的分子鏈，改變木質素的性質，使其變為易降解的低分子量聚合木質素片段［18］。降解秸稈的細菌有地衣芽孢桿菌、假單胞桿菌、亮絲桿菌、產堿桿菌、枯草芽孢桿菌等。有學者利用稀釋平板法篩選出一株耐熱并高效降解秸稈的細菌，經鑒定為地衣芽孢桿菌［19］；賀蕓［20］利用分離篩選方法得到一株產胞外耐高溫纖維素酶的細菌，鑒定為嗜熱脂肪芽孢桿菌。陳麗燕等［21］從腐爛枯枝落葉土壤中分離篩選得到2株產纖維素酶的菌株，分別鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），液體搖瓶培養4 d后，CMC酶活分別可達163.3 U/mL 和167.17 U/mL。呂明生等［22］從海水和海泥樣品中分離篩選出一株產纖維素酶的菌株，經鑒定為交替假單孢菌屬（Pseudoalteromonas sp.），該菌株為革蘭氏陰性桿狀細菌，有莢膜，無芽孢，生長溫度范圍為4-35℃，最適生長溫度為25℃；最適生長pH為8.0；最適生長NaCl濃度為3%。

放線菌生長繁殖速度緩慢，但其生長的酸堿范圍和溫差范圍很寬，并可以在惡劣環境下形成芽孢，適應周圍環境的能力極強，是一類降解秸稈能力較強的微生物。研究表明降解秸桿的放線菌主要有鏈霉菌屬（Streptomyces）、黑紅旋絲放線菌（Actinomyces melaocyclus）、玫瑰色放線菌（Actinomyces roseodiastaticus）、纖維放線菌（Actinomyces cellulosae）、小單胞菌（Micromonospora）等，其降解機制主要是放線菌可以比較容易的穿透秸稈纖維等不溶基質，在中、堿性環境中增加秸稈的水溶性，促進秸稈快速降解。宋波等［23］從草食性動物的糞便中篩選得到1株能降解纖維素的菌株，經過鑒定為鏈霉菌屬。周新萍等［24］從朽木中分離得到一株產纖維素酶活力較高的放線菌NC-7，鑒定為生二素鏈霉菌（Streptomyces ambofaciens）。

真菌能分泌胞外酶，且菌絲對難降解的木質素醋質層具有機械穿插作用。因此，真菌對纖維素、半纖維素和木質素有很強的分解作用，是降解秸稈效率最好的微生物菌群，同時也是目前研究最多的降解秸稈的微生物。20世紀中葉以來，科學家們獲得了大量降解秸稈的真菌，尤以木霉屬（Trichoderma）、青霉屬（Penicillium）、漆斑霉屬（Myrothecium）、毛殼霉屬（Chaetomium）、曲霉屬（Aspergillus）等為主［25-29］。有學者利用稀釋涂布平板的方法從土壤中分離篩選出 4株降解秸稈能力較強的真菌，鑒定為肉座菌屬的黃曲霉、草酸青霉、木霉和煙曲霉［30］。魏亞琴等［31］從位于蘭州市榆中縣的興隆山國家自然保護區采集的腐土中分離篩選出一株CMC酶活高達1 376.2 IU/mL，FPA酶活高達497.78 IU/mL的菌株，初步鑒定該菌株屬于青霉屬。協助降解秸稈的酵母菌主要有啤酒酵母、粗球孢子菌和釀酒酵母等。降解秸稈的霉菌主要有青霉、曲霉、木霉、毛殼菌和白腐菌等［32-35］。張明珠等［36］從腐木和土壤中篩選出一株綠色木霉，其CX 酶活達23.49 U/mL。該菌可使秸稈的纖維素含量降低14%、木質素含量降低2.8%。有學者［37］采用康氏木霉和黑曲霉與乳酸菌共同厭氧發酵秸稈，結果顯示，菌群能有效降解秸稈的細胞壁。

3 低溫秸稈降解微生物的選育方法

低溫環境是地球表面最豐富的環境，約占70%。在低溫環境中存在著很多生物體，特別是細菌、真菌等微生物。根據低溫微生物生長溫度的不同將其劃分為嗜冷菌（Psychrophiles）和耐冷菌（Psychrotrophys）。嗜冷菌的最高生長溫度為20℃，而耐冷菌能在0℃條件下生長，但生長的上限溫度必須低于40℃。低溫微生物適應環境的能力主要得益于其體內的生化反應能在低溫下高效進行。適應低溫的能力包括生物體能夠在低溫下生產和保存適當的新陳代謝產物，并且參與代謝的酶在低溫下具有高效的催化活性。低溫環境下水的黏度會明顯增大，熱運動會顯著降低，酶分子要在這樣的環境下保持有效的催化效率，必須使結構更加柔韌。已報道的低溫秸稈降解菌既有嗜冷菌又有耐冷菌，一般最適生長溫度在10-25℃，多數不能在超過37℃的條件下生長［38］。隨著科學研究的不斷深入，學者們在低溫秸稈降解微生物選育方面也積累了豐富的經驗。最早，科學家是直接從自然界中人工篩選優良的菌種，但是由于自然選育不能滿足人們的生產需要，人們開始運用新興的育種方法如誘變育種、原

生質體融合育種、基因工程育種等選育菌株。

3.1 從自然界中篩選育種

由于微生物具有適應強、易變異的特點，所以在自然界中存在許多具有特殊功能的菌株。早期應用在酒精、乳酸、丙酮、丁醇生產中的優良菌種，主要是從自然界中篩選獲得的。自然篩選仍然是目前獲得降解秸稈高效菌種的方法之一，如薩如拉等［39］從腐爛的樹葉和高原鋸末中篩選到兩組玉米秸稈降解復合菌系1號和8號。1號和8號復合菌系在玉米秸稈培養基中，15℃培養15 d，玉米秸稈分解率分別達到30.21%和32.21%。張恒芳等［40］在低溫條件下通過初篩、復篩，從腐爛的玉米秸稈垛土壤中分離出2株在低溫條件下降解玉米秸稈能力較強的菌株，處理玉米秸稈10 d，降解率分別達30.80%和31.52%。直接從自然界中篩選菌株也存在缺點，如自然界中菌株的突變率低，對目標性狀的正突變少，缺乏定向誘變的能力，工作量大，篩選效率低下等，需要新興的育種方法提高選育菌株的效率，為進一步開發利用微生物資源提供技術支撐。

3.2 原生質體融合育種

原生質體融合是指利用物理、化學或生物的手段將兩種不同親株的脫壁細菌細胞或植物細胞的原生質體合并到一起，使細胞內的遺傳物質發生重組交換，獲得兼有雙親性狀的穩定重組子的過程。原生質體融合育種的優勢在于其可以提高變異的頻率，縮短育種時間。目前，采用原生質體融合技術選育穩定高產纖維素酶菌株的研究越來越多。張新峰等［41］采用紫外線對嗜熱真菌原生質體進行誘變處理，成功選育出3株遺傳性能穩定的木聚糖酶高產誘變株，木聚糖酶的酶活分別提高了26.5%、37.78%和28.2%。胡婷婷等［42］利用紫外線誘變綠色木霉的原生質體，通過剛果紅透明圈法篩選得到一株高產纖維素酶的菌株，其CMC酶活力比綠色木霉原菌提高了124.3%。黑曲霉的β-葡萄糖苷酶活力很高，而里氏木霉外切葡聚糖酶、內切葡聚糖酶活力很高，這樣就可以考慮利用原生質體融合技術把黑曲霉和里氏木霉這兩個菌株的原生質體進行融合，使兩個菌株實現優勢性狀互補［43，44］。原生質體融合技術操作復雜，產生的雜交后代同樣沒有定向性，而且必須有非常簡便的篩選手段相配合才行。

3.3 物理化學誘變育種

物理化學技術是一種方便快捷的誘變選育優良微生物菌種的方法。這種方法可以使菌株的遺傳性狀發生很大的改變，提高菌株的突變頻率，縮短獲得目的性狀菌株的程序和時間。常用的化學誘變劑有亞硝基胍、亞硝酸、硫酸二乙酯等；常用的物理誘變劑有紫外線、60Co-Y射線等。管斌等［45］利用紫外線、亞硝基胍等對里氏木霉進行低劑量、反復多次復合誘變處理，以2-脫氧葡萄糖代替葡萄糖作為阻遏物的結構類似物，篩選出一株纖維素酶活力比初始菌株高3倍的菌株。張苓花等［46］對康氏木霉W-925、J-931用濃度為2%硫酸二乙酯和紫外線復合誘變后，得到了一株誘變菌株，其CMC酶活性提高了100%，濾紙糖酶活性提高了81%。劉羽［47］利用紫外燈誘變從南極樣品中分離篩選到能產生低溫高效纖維素酶的菌株 QP7，得到一株具有比較穩定的遺傳性的突變菌株QP7-1，它的酶活比出發菌株提高了24%。還有學者利用紫外線誘變擬康氏木霉，用具有葡萄糖濃度梯度的雙層平板篩選，獲得1株可以抗產物10%葡萄糖的突變株，該菌株制成干曲后其CMC酶活達1 145.7 IU/mL；濾紙酶活達到55.6 IU/mL［48］。陳光等［49］利用快中子對綠色木霉進行福照誘變，研究了不同劑量快中子對綠色木霉孢子遺傳穩定性和致死率的影響。結果顯示：福照劑量在1.2-4.8 Gy范圍內綠色木霉的致死率隨福照劑量的增加而上升，福照劑量為1.2 Gy時，綠色木霉的致死率達80%。篩選獲得的突變株的CMC酶活達914.4 IU/mL，比出發菌株高30倍，FPA酶活為633.63 IU/mL，比出發菌株高4倍。物理化學誘變育種方法對菌株的致死率較高，并且誘變劑會污染環境，突變沒有方向性，篩選鑒定的工作量較大，同樣需要快捷高效的篩選方法配合。

3.4 基因工程育種

隨著生物技術的迅猛發展，學者們開始利用基因工程手段克隆纖維素酶基因，并將其克隆至多種細菌和真菌，獲得了高產纖維素酶的工程菌株。Wang等［50］利用致錯突變株技術、易錯PCR改造里氏木霉的內切葡聚糖酶基因eg3，獲得一個

突變體321T，與出發菌株相比，其酶的最適pH升高了0.6個單位。Kim等［51］利用DNA改組技術改造來自枯草芽孢桿菌的內切葡聚糖酶基因，獲得了一株CMC酶活力比出發菌株高2.2倍的工程菌。游銀偉等［52］從黃海海底淤泥中篩選出一株產纖維素酶的適冷革蘭氏陰性桿菌MB1，克隆和分析了MB1 的16S rDNA 序列，經鑒定為交替假單胞菌（Pseudoalteromonas）。克隆該菌適冷內切葡聚糖酶基因celA，并在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21 中進行了表達。重組E. coli 菌體破碎后，獲取上清液，其中融合蛋白GST-CelA 濃度約為78.5 mg/L，分析融合酶GST-CelA 的性質，為中性適冷酶。熊鵬鈞［53］從深海沉積物樣品中分離到一株具有高內切葡聚糖酶活力的細菌DY3，研究表明DY3在8℃環境中分泌的胞外酶能水解羧甲基纖維素。設計PCR引物從DY3總DNA中擴增出一個約1.5 kb的片段并將該片段克隆到T載體上進行測序。分析表明該片段長為1 479 bp，是一個屬于糖基水解酶家族5的纖維素酶基因，命名為celX，利用pET-GST載體，celX基因在大腸桿菌E.coli BL21（DE3）中獲得融合表達。表達純化的產物能降解CMC產生纖維二糖和纖維三糖，分解纖維五糖產生纖維二糖和纖維三糖，分解纖維四糖產生纖維二糖。喬宇等［54］利用巴斯德畢赤酵母表達系統導入里氏木霉eg2基因，獲得一株能夠高效表達內切葡聚糖酶II的工程菌株Gp2025。利用甲醇誘導表達后，內切酶活力達到1 573.0 IU/mL。

4 低溫秸稈降解微生物菌劑的應用

秸稈腐熟菌劑是通過現代生物及化學技術生產的微生物活體菌劑，能夠促進農作物秸稈以及其他有機物料的腐熟［55］。早期研發秸稈腐熟劑時，研究人員主要利用純菌降解秸稈，直到發現降解效果不理想后才開始進行多種菌株組合降解秸稈的研究。隨著研究的不斷深入，通過菌株淘汰和優化組合技術以及多種微生物之間的協同關系，人工篩選多個菌源，并構建產高效纖維素酶的復合腐熟菌劑，成為了腐熟菌劑研究的熱點［56］。為了達到腐熟菌劑作用秸稈后不僅不影響下季作物的播種及生長，還可以增加農作物的產量，人們在腐熟菌劑的腐解穩定性、腐解效果以及安全性等方面進行了大量的研究，以便實現秸稈的直接還田、解決秸桿再生利用的問題［57］。秸稈腐熟菌劑的研究中，以嗜熱的秸稈纖維素、木質素分解菌為主，而常溫特別是低溫發酵分解秸稈纖維素、木質素的菌株或菌群的研究較少，遠遠不能滿足實際生產的需要。趙明文等［58］研究發現，接種分解菌群的秸稈廢棄物發酵34 d后，與不接種的相比，秸稈分解率提高了13.6倍。在接種分解菌群的后75 d，作物的分葉數增加37.5%、單株干重增加19.77%、次生根增加11.87%；成熟時，有效穗增加了4.22%、每穗實粒數增加了1.72%、干粒重增加了2.08%、實際產量增加了8.42%。還有學者［59］研究對比了5種秸稈腐熟菌劑對稻稈的腐熟程度及對晚稻生長發育的影響。結果顯示，5種腐熟劑都能使土壤中的有機質和各類營養成分顯著提高，對晚稻的增產效果也很顯著，但是5種腐熟菌劑處理間的差異不顯著。丁波等［60］的研究表明，在田間鋪蓋的秸稈上噴灑秸稈腐熟劑后，小麥的增產高達101.6%-109.9%。秸稈在腐熟時需嚴格控制水分，菌劑的均勻程度及對秸稈的密封等都將影響腐熟的效果。秸稈堆漚還田主要采用厭氧發酵，這種方法雖然成本低廉，但存在堆漚時間長、受環境影響大的缺點，需要進一步研究獲得能在低溫條件下快速腐解秸稈，并促進農作物增產的微生物菌劑。

5 展望

秸稈還田不僅可以培肥地力、改善土壤理化性質，還能促進土壤中有益微生物種群的生長繁殖，能有效抑制各種病菌的生長，減少病害的發生。秸稈降解的關鍵是微生物技術的利用，而獲得優良的菌株是微生物技術的核心。我國北方地區農作物秸稈數量巨大，但由于秋冬季節溫度過低，秸稈還田后不易腐解，影響來年作物的播種及生長。在北方地區的溫度條件下，分離篩選高效降解作物秸稈的菌株，并制備成復合菌劑，為解決我國北方地區作物秸稈的原位還田提供有力的技術支持，促進北方地區作物秸稈的合理開發利用，對解決我國糧食和資源短缺以及環境污染都有重大的現實意義。目前，雖然對低溫秸稈腐解微生物進行了研究，但篩選獲得的低溫秸稈降解菌株數量有限，降解秸稈的能力

不高，并且低溫條件下降解秸稈主要有哪幾類微生物，秸稈降解不同階段的優勢種群有哪些，分解秸稈的酶在低溫條件下是怎樣發揮作用的，以及低溫條件下菌落的演替規律等都需要進一步的研究。

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（責任編輯 狄艷紅）

Advanced in Microbiological Agent of Straw Degradation Under Low Temperature

Zhao Xu Wang Wenli Li Juan Hu He
（Institute of Soil，Fertilizer and Water-saving Agriculture，Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730070）

The components of straw are cellulose, hemicellulose and lignin. Straw degradation microorganisms including bacteria, actinomyces and fungi. The methods of breeding straw degradation microorganisms include screening from nature, mutation breeding, protoplast fusion breeding, gene engineering breeding and so on. At present, the straw degradation strains under low temperature can be screened few in number, the ability of straw degradation is confined, further study need to be done on the mechanism of low temperature straw degradation. Microbiological agent of straw degradation under low temperature was summarized.

Degradation under low temperature Crop straw Microorganisms Straw return to field

2014-04-14

甘肅省農業科學院農業科技創新專項（2012GAAS15-1）

趙旭，男，碩士，助理研究員，研究方向：農業微生物，環境微生物工程；E-mail：zhaoxv6939438@163.com