重組酵母產人IFN-α2a與LL-37融合蛋白的工藝優化

張明杰

（廣東紫金正天藥業有限公司，河源 517000）

重組酵母產人IFN-α2a與LL-37融合蛋白的工藝優化

張明杰

（廣東紫金正天藥業有限公司，河源 517000）

通過單因素試驗探索重組酵母P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的最佳條件。結果顯示，重組酵母菌產蛋白酶的最佳表達條件是利用BMMY為誘導培養基，以接種量OD600=5.5、溫度26℃、pH6.0、誘導劑（甲醇）為每隔24 h添加1.0%、振蕩速度為200 r/min條件下連續誘導144 h。在最佳培養條件下，發酵液中的LL-37最高抗菌活性達27.9 mm。與初始的發酵條件相比，人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的產量提高了32.29%。

干擾素α2a LL-37 工藝

英國科學家Isaacs和Lindenmann于1957年發現一種能干擾病毒感染的細胞因子，命名為干擾素［1］。隨著人類研究的深入，不斷發現了許多新的干擾素分子。目前，人類在哺乳動物中發現的干擾素共有10個家族，其中人干擾素有7個家族。按其功能和作用方式，可將人干擾素細分為I型、II型和III型。I型包括α、β、ε、τ、ω、κ，具有抗病毒和抗腫瘤的功能；II 型包括γ，具有調節免疫的功能［2］；III型為干擾素樣蛋白，功能與I型類似，但受體不同［3］。人IFN-α2a是由165個氨基酸殘基構成，具有防治病毒性疾病［4］和惡性腫瘤［5］的功能。LL-37是目前在人體內發現的抗菌肽Cathelicedin家族中唯一的成員，對革蘭氏陽性菌和陰性菌均具有較廣譜的抗性［6］。除此之外，LL-37還具有免疫調節作用，可趨化單核細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞和肥大細胞等［7］。當人體受到病原微生物、炎癥或創傷刺激，LL-37的表達水平就會上升［8］。動物試驗表明，LL-37可明顯降低銅綠假單胞菌感染小鼠的死亡率［2］。

將人LL-37基因與IFN-α2a融合表達，形成同時具有抗病毒、抗腫瘤和抗菌的三重功效的新功能蛋白，在一些特殊的臨床治療中存在潛在的市場需求。本課題組前期的工作實現了在畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115表達三功能的人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白。在進入工業化生產之前，有必要建立所構建的基因工程菌工藝條件，并對產品的應用

性能進行驗證。本研究通過單因素試驗旨在探索重組酵母P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 P. pastoris GS115LI，表達人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白。大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922，用于檢測融合蛋白的抗菌活性。

1.1.2 培養基

1.1.2.1 YPD培養基 酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，121℃滅菌30 min。

1.1.2.2 BMGY培養基 見參考文獻［10］。

1.1.2.3 BMMY培養基 同BMGY培養基，僅將其中的甘油10 mL換為甲醇5 mL。

1.1.2.4 初始培養基 種子培養：保藏的菌種先經YPD活化，后將入BMGY培養基，接種量2%，后振蕩培養。培養條件：溫度28℃，轉速200 r/min，培養時間24 h。

誘導培養：種子培養液離心去培養液，后接種入BMMY培養液，使酵母OD600值達6.0，在溫度28℃與轉速150 r/min下振蕩培養，每24 h補充甲醇0.5%（體積比）誘導表達［11］，重復誘導5次。

1.2 方法

1.2.1 單因素發酵試驗

1.2.1.1 誘導時長對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響 按出發條件進行誘導，誘導過程中每12 h取樣分析發酵液抗菌活性，直至檢測的抗菌活性不再上升。

1.2.1.2 接種量對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響 按前述確定的最佳誘導時長，分別調節接種量以OD600計為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，其它條件不變。誘導完成后取發酵液分析抗菌活性。

1.2.1.3 溫度對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響 在出發條件的基礎上，按前述確定的最佳誘導時間與接種量，改變誘導溫度，分別置于24℃、26℃、28℃、30℃和32℃下振蕩培養。培養完后取樣檢測產物的抗菌活性。

1.2.1.4 溶氧對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響 通過改變搖床的轉速探索溶氧對重組P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響。分別選擇搖床轉速為120、160、240和280 r/min進行誘導培養，其它條件參照前述選擇的最佳條件。誘導結束后取發酵液分析抗菌活性。

1.2.1.5 誘導劑（甲醇）添加量對P. pastoris GS115-LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響 通過改變誘導劑甲醇的添加量分別對體積比為0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%和1.6%的菌株進行誘導表達。其它誘導條件為前述所確定的最佳條件。誘導結束后取發酵液分析抗菌活性。

1.2.1.6 pH對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響 為了探索pH對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響，分別選擇pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0進行試驗。其它發酵條件為前述優化的最佳條件。誘導結束后取發酵液分析抗菌活性。

1.2.2 驗證試驗 在上述確定的最適培養和誘導表達條件下，重復試驗3次，進行驗證。

1.2.3 發酵液中人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的抗菌活性分析 培養液中LL-37的活性測定參照文獻［5］。用E. coli ATCC 25922作為檢測菌種，用雙層瓊脂糖打孔法測定。底層培養基上打直徑3 mm的圓孔，每孔加10 μL發酵液，37℃孵化3 h后，在底層上覆蓋一層營養瓊脂，37℃繼續培養20 h，測量無菌生長的透明圈直徑。

2 結果

2.1 誘導時長的影響

誘導時長對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響結果（圖1）顯示，誘導開始后的前24 h，發酵液中檢測出的以抗菌活性表示的融合蛋白產量上升較慢，這可能與菌體本身處于環境適應期的延遲期有關；而后產量呈直線上升，至第132 h，此后產量緩慢上升，至144 h達到最大值25.3 mm；此后24 h的誘導期內，融合蛋白產量出現輕微下降，可能是由于宿主老化后，產品有所降解引起。根據以上試驗結果，確定144 h為最佳誘導時長。

圖1 誘導時長對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響

2.2 接種量的影響

接種量對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響結果（圖2）顯示，隨著接種量自OD600=3.5上升，在其它條件不變的情況下，發酵液中以LL-37抗菌活性表示的人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白逐漸上升，至接種量達到OD600=5.5后，達到最大值約26.0 mm；之后，呈現逐漸下降的趨勢。這表明，當OD600＜5.5，發酵液中的酵母濃度太少，導致表達能力低。在OD600=5.5時達到飽和。之后再升高酵母濃度，可能由于營養或溶氧供應受限，從而導致產物的合成能力不升反降。在此，選擇接種量為OD600≈5.5作為最佳的接種條件。

圖2 接種量對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響

2.3 溫度的影響

溫度對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響結果（圖3）顯示，在溫度為26℃時，以抗菌活性表示的人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白產量最高，可達26.5 mm以上。溫度低于26℃，產量會有所下降，可能與低溫下酵母代謝活性受影響有關。溫度高于26℃，產量也出現下降，可能與在溫度高時，酵母自身代謝加快后，衰老同樣加快的原因。綜合上述情況，選擇26℃作為誘導時的最佳溫度條件。

圖3 溫度對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響

2.4 溶氧的影響

在搖瓶階段，溶氧難以直接測定，故只能采用以搖床振蕩轉速為依據來進行探索。溶氧對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響結果（圖4）顯示，在振蕩轉速低于200 r/min時，由于溶氧處于受限狀態，故以抗菌活性表示的人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白產量較低。振蕩轉速高于200 r/min后，產量不再繼續上升，表明此階段溶氧已經到達飽和。綜合考慮效應與成本，選擇200 r/min作為誘導表達時最佳的溶氧控制條件。

圖4 溶氧對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響

2.5 誘導劑（甲醇）添加量的影響

誘導劑（甲醇）添加量對P. pastoris GS115LI產

人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響結果（圖5）顯示，甲醇濃度添加量為1.0%（以體積比計，下同）時，以抗菌活性計的人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白表達量達最大，約為27 mm。低于1.0%，可能是由于誘導的強度不夠，表達速度下降，致使產物產量下降。高于1.0%，可能是由于誘導強度太大，超出了宿主菌的代謝負荷，反而產生負作用，從而也使表達量下降。綜合考慮選擇1.0%為誘導的最佳甲醇用量。

圖5 甲醇添加量對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響

2.6 pH的影響

pH對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響結果（圖6）顯示，試驗條件下，pH6.0時人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的表達量最高，達到27.5 mm以上。pH主要通過影響細胞膜及基質的帶電狀態，從而影響膜對基質的通透性，再傳遞到對產物產量的影響。酵母的最適生長pH為偏酸性的環境，此處產物最佳表達量所需的pH6.0，恰好可在不影響宿主本身生長條件下實現產物的最佳表達，故確定pH6.0為最佳條件。

圖6 pH對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響

2.7 最佳工作條件驗證

根據前面的試驗結果，確定P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的最佳工藝條件為利用BMMY培養基，接種量以OD600計為5.5、溫度26℃、pH6.0、誘導劑（甲醇）為每隔24 h添加1%、振蕩速度為200 r/min條件下連續誘導144 h。在該工藝條件下重復驗證3次，得到結果（以LL-37抗菌活性計）分別為27.8、28.1和27.9 mm，平均值為27.93±0.12（mm）。該結果與出發培養條件下的表達量（21.1 mm，參考1.2.1.1誘導時間120 h時的結果）相比，產物產量提高了32.39%。

3 討論

LL-37作為人源性抗菌肽，已經在臨床上獲得廣泛的應用。由于其分子小，與其它蛋白多肽或蛋白類藥物融合表達時，不易對與其融合蛋白的功能產生影響，因此將LL-37與其它蛋白融合表達生產多功能藥物成為可能［13］。例如，將LL-37與人酸性成纖維細胞生長因子融合表達形成的新蛋白，既具有酸性成纖維細胞生長因子促進傷口愈合的功能，又具有防止傷口感染的功能［14］。受此思路的啟發，將LL-37與人IFN-α2a融合表達，構建出了同時具有抗癌、抗病毒和抗菌的三效藥物。發酵工藝是將構建的蛋白轉化為產物的關鍵。

從單因素試驗的各因素變化所引起的人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白表達水平的波動情況分析，接種量、時間和pH是3個較為敏感的量，其它屬于次敏感量，這可能預示著這些因素對表達產量的關鍵程度。接種量主要影響發酵時延遲期的長短和菌體與營養之間的協調關系。接種量小，延遲期長，產物合成量低；接種量大，菌體濃度高，會引起營養競爭［15］。pH不僅影響宿主菌對外源基因的表達，同時也可能對產物的穩定性及活性產生影響［16］。適宜的培養條件，有利于提高細胞的相對活性和延長細胞的高相對活性狀態，從而實現融合蛋白產量的最大化累積［17，18］。各因素之間的影響還需要通過正交試驗或序貫試驗設計，利用統計學的原理進行詳細分析。

試驗中為了操作的方便，僅以LL-37的抗菌

活性進行表征。經過在菌種構建階段的試驗確認，LL-37的抗菌活性檢測與IFN-α2a干擾素活性檢測結果是相一致的，表明二者既實現了融合，而且融合蛋白還同時保留了二者各自獨立時的活性（結果發表在本課題組另一篇文章中）。

本試驗所有數據均是建立在搖瓶的試驗基礎之上的。眾所周知，搖瓶并不能真正代替發酵罐的生產，因此本試驗的結果還只能是發酵生產的參考。在達到生產水平之前，還需通過小型發酵罐進一步優化工藝參數，再逐步放大至生產規模。

4 結論

本研究確定了重組畢赤酵母P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的最佳工藝條件為利用BMMY培養基、接種量以OD600=5.5、溫度26℃、pH6.0、誘導劑（甲醇）為每隔24 h添加1%、振蕩速度為200 r/min條件下連續誘導144 h。與出發條件相比，產量提高了32.29%。

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（責任編輯 馬鑫）

The Process Optimization of Pichia pastoris GS115LI for Producing Fused Protein of LL-37 and IFN-α2a

Zhang Mingjie
（Pharmaceutical Co.，Ltd. Guangdong Zijing Zhengtian，Heyuan 517000）

With experiments of single factor, the optimal process of recombinant P. pastoris GS115LI for producing fused protein of LL-37 and IFN-α2a were using BMMY as inducing medium, inoculum as OD600=5.5, temperature as 26℃, pH6.0, inducing chemical（methanol）adding amount as 1.0% every 24 h, incubating shaking speed as 200 r/min, and inducing time as 144 h. Under those optimal conditions, the 27.9 mm of LL-37 antimicrobial activity could be gotten. Compared with the original conditions, the productivity of fused protein of LL-37 and IFN-α2a was increased as 32.29%.

Interferon-α2a LL-37 Fermentation process

2014-03-18

廣東省重大科技專項（2011A080502011）

張明杰，教授，研究方向：微生物工程技術；E-mail：mingjiezh@126.com