自誘導系統在酶促合成2’-脫氧胞苷中的應用

王璽段勝林熊舒莉鄭桂蘭張貴友王洪鐘

（1.清華大學生命科學學院，北京 100084；2.中國食品發酵工業研究院，北京 100015）

自誘導系統在酶促合成2’-脫氧胞苷中的應用

王璽1段勝林2熊舒莉1鄭桂蘭1張貴友1王洪鐘1

（1.清華大學生命科學學院，北京 100084；2.中國食品發酵工業研究院，北京 100015）

旨在高效合成2’-脫氧胞苷（dCyd）。DCyd作為一類重要的藥物中間體，能夠用于合成吉西他濱（dFdC）、扎西他濱（ddC）等多種抗病毒或抗腫瘤的藥物。采用ZYM-Fe-5052自誘導培養基對含有N-脫氧核糖轉移酶II（NDT）的大腸桿菌BL21（DE3）進行誘導，所得完整菌體直接用于催化合成dCyd。結果表明，自誘導系統不僅無需額外添加誘導劑，還能夠達到較高的菌體密度，且與LB誘導系統所得菌體在合成dCyd方面具有同樣高效的催化活性。2’-脫氧胸苷（dThd）和胞嘧啶的濃度比為1∶3時，產物轉化率可高達86.5%。合成dCyd的最適反應條件為：2’-脫氧胸苷（dThd）和胞嘧啶的濃度比為1∶1.5，pH6.5的磷酸緩沖液，1 mg/mL的菌體量，終體系10 mL，30℃條件下反應1 h，產物轉化率可達71.9%。此方法還可用于制備其他核苷類似物，具有廣泛的適用性和應用前景。

生物催化 N-脫氧核糖轉移酶 2’-脫氧胞苷 自誘導系統 核苷類似物

核苷類家族不僅包含多種天然核苷，還包括堿基或糖基被修飾過的核苷類似物［1］。核苷類似物的化學結構與天然核苷有著不同程度的相似性，在細胞代謝中，可與正常核苷形成競爭關系，具有干擾核酸的合成及抑制相關聚合酶結合的作用，進而阻斷腫瘤細胞和病毒的復制［2］。大部分的核苷類似物可以在治療癌癥和病毒感染的疾病中發揮重要作用［3-5］。其中，2’-脫氧胞苷（2’-deoxycytidine，dCyd）就是一類重要的藥物中間體，能夠用于合成抗癌藥物吉西他濱（dFdC）、抗HIV病毒藥物扎西

他濱（ddC）及生化試劑脫氧胞苷-5’-單磷酸（5’-dCMP）［6］等。目前，制備核苷類似物的方法主要有化學合成法和生物轉化法。傳統的化學合成法存在步驟繁多，反應條件苛刻，產物純度低、分離困難，收率不高等缺點［7，8］，故在工業生產中很少使用。生物轉化法主要用到兩種酶：核苷磷酸化酶和N-脫氧核糖轉移酶，前者通過2步反應可逆地催化核苷（或脫氧核苷）生成核糖-1-磷酸和堿基，核糖-1-磷酸再與另一種堿基結合生成新的核苷，但此酶不能用于催化合成胞嘧啶核苷類化合物［9］；后者主要來源于大腸桿菌、萊氏乳細菌和瑞士乳桿菌［10］，可通過一步催化反應高效地合成核苷類似物，反應過程中無中間體的產生［9］，且底物適用范圍更廣。

N-脫氧核糖轉移酶最先是由MacNutt在瑞士乳桿菌中發現的［11］。隨后有研究者利用親和層析的方法從瑞士乳桿菌中純化得到含有兩種不同活性的N-脫氧核糖轉移酶［12］：I 型（PDT），只能催化兩種嘌呤堿基之間的轉換反應（Pur ? Pur）；II型（NDT），不僅可以催化兩種嘌呤之間的轉換，還能夠催化嘧啶與嘧啶、嘌呤與嘧啶之間的相互轉換（Pur ?Pur，Pur ? Pyr，Pyr ? Pyr）［13，14］。N-脫氧核糖轉移酶II（NDT）的底物識別范圍較廣，能夠用于合成多種有重要藥用價值的核苷類似物［15，16］，但其更傾向于催化以脫氧嘧啶核苷為底物的反應［17］。已有文獻報道，NDT基因的開放閱讀框由474個核苷酸組成，用于編碼158個氨基酸［18］。本試驗即利用分子生物學手段構建得到含有NDT的原核表達菌，以脫氧胸苷和胞嘧啶為底物，在重組菌體的催化下高效合成2’-脫氧胞苷。

IPTG是對于lac基因簇十分有效的誘導劑，人們對其的研究已經比較成熟［19］。但由于IPTG具有價格昂貴、細胞毒性大等缺點，在菌種的大規模培養中不太適用［20］，而乳糖相對廉價且可以代替IPTG誘導乳糖操縱子的表達［21］。本試驗即利用含有乳糖的ZYM-Fe-5052自誘導培養基誘導培養構建得到的重組大腸桿菌BL21/pET28a-ntd（BN）細胞，收集得到的全菌體直接用于催化2’-脫氧胞苷的合成。此自誘導培養基是由Studier在標準5052培養基的基礎上改良得到的［22］，其中0.5%的甘油、0.05%葡萄糖和100 μmol/L FeCl3有利于菌體的高密度培養［23］，而0.2%的乳糖可以誘導酶的過量表達。本試驗對比傳統LB誘導系統與自誘導培養途徑獲得的菌體的生物轉化活性，并對全菌體催化合成2’-脫氧胞苷的反應條件進行優化，旨在為自誘導培養基的進一步應用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 胞嘧啶、胸腺嘧啶、脫氧胸苷和脫氧胞苷均購自于上海得恩德醫藥科技有限公司，Ex Taq DNA聚合酶、Nde I和EcoR I限制性內切酶均購自于TaKaRa生物技術有限公司，DNA回收試劑盒和質粒提取試劑盒購自于北京全式金生物技術有限公司。

1.1.2 儀器 Waters 600 series高效液相色譜儀，PCR儀，SDS-PAGE蛋白電泳系統，DYⅢ20A型水平電泳槽，紫外分光光度計，恒溫搖床，離心機等。

1.1.3 菌種和質粒 瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）購自于中國普通微生物菌種保藏管理中心，pMD18-T質粒，克隆菌株大腸桿菌DH5α和表達菌株大腸桿菌BL21（DE3）均購自于全式金生物技術公司，pET-28a（+）質粒購自于Novagen公司。

1.1.4 培養基

1.1.4.1 MRS液體培養基 蛋白胨1%，牛肉膏1%，葡萄糖0.5%，酵母提取物0.5%，檸檬酸二銨0.2%，乙酸鈉0.5%，吐溫80 0.1%，磷酸氫二鉀0.2%，硫酸鎂0.02%，硫酸錳0.005%，碳酸鈣2%。用氫氧化鈉溶液調節pH值為6.8，121℃滅菌15 min。

1.1.4.2 LB液體培養基 酵母提取物0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉1%，121℃滅菌15 min。

1.1.4.3 ZYM-Fe-5052自誘導培養基 蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，甘油0.5%，0.2%乳糖，0.05%葡萄糖，25 mmol/L Na2HPO4，50 mmol/L NH4Cl，25 mmol/L KH2PO4，5 mmol/L Na2SO4，2 mmol/L MgSO4，100 μmol/L FeCl3，121℃滅菌15 min。

配制相應的固體培養基時，加入1.5%左右的瓊脂后滅菌。

將含有目的基因片段的瑞士乳桿菌在MRS培養基中復蘇培養［24］。構建完成的原核表達菌株利用兩種誘導系統進行誘導表達：LB培養基加IPTG誘導

劑和ZYM-Fe-5052自誘導培養系統。

1.2 方法

1.2.1 表達菌株的構建 將瑞士乳桿菌干粉于MRS液體培養基中復蘇培養24 h后，傳代進行2次培養，以此菌液為模板進行PCR來擴增目的片段。利用GenBank中查找得到的瑞士乳桿菌N-脫氧核糖轉移酶II基因（ndt）的核酸序列（登錄號：NC-010080），設計一對擴增引物：ndt（+）：5'-CGCCATATGATGAACAAGAAAAAGAC-3'和 ndt（-）5'-CGGGAATTCTTAATATACAGCTCCG-3'，下劃線標注序列分別為Nde I和EcoR I限制性酶切位點。PCR反應體系中包含10×Ex Taq緩沖液II 5 μL，dNTP 5 μL，引物各0.5 μL，菌液模板1 μL，Ex Taq DNA聚合酶 0.25 μL，補加ddH2O至終體積50 μL。PCR反應條件：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火60 s，72℃延伸90 s，30個循環；72℃保溫10 min，4℃保存。

利用DNA膠回收試劑盒對PCR產物中的目的片段進行回收，與pMD18-T克隆載體在16℃條件下連接8 h后，轉化進入大腸桿菌DH5α感受態細胞中，通過測序及序列比對篩選獲得陽性克隆菌株。然后用Nde I和EcoR I限制性內切酶分別對pMD18-T-ndt和pET-28a質粒在37℃水浴鍋中進行雙酶切，所需酶切片段進行DNA回收后16℃條件下連接8 h，并轉化導入表達菌株BL21（DE3）中，篩選得到重組大腸桿菌BL21-pET28a-ndt（BN）陽性表達菌株。

1.2.2 N-脫氧核糖轉移酶II基因的表達及SDSPAGE檢測 表達菌株BN在兩種誘導系統中進行誘導培養，利用分光光度計分別測定兩種誘導途徑所產生的菌體密度的增長曲線。用于獲得含酶菌體的兩種誘導方法為：①將1 mL過夜復蘇培養的BN菌液加入到50 mL含有50 μg/mL卡那霉素的傳統LB培養基中，培養至OD600為1.0左右，加入0.1 mmol/L的IPTG，繼續誘導培養4 h。②將1 mL過夜復蘇的BN菌液加入到50 mL含有50 μg/mL卡那霉素的ZYM-Fe-5052自誘導培養基中，培養總時間與LB誘導系統相同。誘導結束后，6 000×g離心10 min收菌，用pH7.0的磷酸緩沖液沖洗一次，菌體保存于-20℃待用。

誘導前及誘導后分別取1 mL菌液，用于SDSPAGE檢測。取樣菌液在12 000 r/min離心2 min，棄上清，沉淀用30 μL的無菌水和10 μL 4×蛋白SDS-PAGE上樣緩沖液重懸，并將重懸溶液于沸水中煮10 min，12 000 r/min離心2 min，取2.5 μL上清用于檢測目的蛋白是否成功表達，并以含有空白pET-28a（+）質粒的BL21（DE3）表達菌株作為對照。所用SDS-PAGE分離膠濃度為15%。

1.2.3 N-脫氧核糖轉移酶II的活性測定 以脫氧胸苷和胞嘧啶為底物，利用表達N-脫氧核糖轉移酶II的完整菌體催化合成脫氧胞苷，通過高效液相色譜儀（HPLC）檢測酶蛋白的催化活性，其反應式如圖1所示。

圖1 合成2’-脫氧胞苷的反應式

初定的標準反應體系（終體積10 mL）為：30 mmol/L 脫氧胞苷和45 mmol/L 胞嘧啶（底物比1∶1.5）溶于50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH7.0）中，在5 mg/mL完整細胞的催化下，40℃恒溫搖床中進行反應。反應結束后，將反應液于沸水中保溫5 min以終止酶反應，冷卻至室溫，然后用超純水稀釋20倍，并用0.45 μm的濾器過濾上清液，用于HPLC的上樣檢測。

HPLC檢測條件為：色譜柱選用Diamonsil C18柱，5 μm（φ250×4.6 mm），紫外檢測波長為245 nm，流動相為15%的甲醇和85%的水，流速1 mL/min，進樣量10 μL，柱溫為25℃。

HPLC圖譜中目的產物的峰面積和產物的產量成正比，本試驗以此為基礎制定了脫氧胞苷的標準曲線。利用標準曲線及反應結束后目的產物的峰面積，可以計算得到產物的轉化率。轉化率（T）的計算方法為：T=（實際脫氧胞苷的產物峰面積/理論

所得脫氧胞苷的產物峰面積）×100%。

1.2.4 酶催化條件的優化 依據N-脫氧核糖轉移酶II的酶學性質［25］及考慮其他可能影響產物生成率的因素，在試驗中分別測定了不同菌體量（1、2.5、5和10 mg）、不同反應溫度（20℃、30℃、40℃、50℃和60℃）對dCyd轉化率的影響。并且依據已有文獻報道，N-脫氧核糖轉移酶II（NDT）在pH接近7.0時催化活性最高［8］，故選擇測定了酸堿度在中性左右的4組不同pH的磷酸緩沖液（5.8、6.5、7.0和7.8）對催化反應的影響。另外，在可逆反應中，不同的底物濃度比對目的產物的轉化率也會存在不同程度的影響。本研究選用相對廉價的脫氧胸苷和胞嘧啶為底物來合成2’-脫氧胞苷，其中，胞嘧啶的價格低于脫氧胸苷。考慮經濟因素，選擇測定了5組不同的底物濃度比（2’-脫氧胸苷∶胞嘧啶為1.5∶1、1∶1、1∶1.5、1∶2和1∶3）對dCyd轉化率的影響。

2 結果

2.1 N-脫氧核糖轉移酶II基因的克隆及重組菌株

的構建

本試驗以瑞士乳桿菌全菌體為模板通過PCR得到N-脫氧核糖轉移酶II的基因片段，目的片段回收后的電泳條帶（圖2-A）顯示，其大小在500 bp左右。NDT基因與pMD18-T質粒連接后，轉化導入大腸桿菌DH5α中，得到陽性克隆菌株菌落鑒定結果（圖2-B），經測序后與GenBank中查找到的序列對比，結果表明序列一致。提取質粒，經雙酶切后，將目的片段與pET-28a（+）質粒相連接，導入表達菌BL21（DE3）中，獲得序列一致的陽性表達菌BN，其菌落鑒定結果（圖2-C）表明，已成功構建得到含有NDT的原核表達菌株。

圖2 ndt的PCR擴增及菌落鑒定

2.2 N-脫氧核糖轉移酶II基因的表達及SDS-PAGE檢測

表達菌株BN在兩種誘導體系中培養相同時間后，離心收集菌體。菌體總蛋白經SDS-PAGE分析（圖3）表明，兩種誘導途徑均能成功誘導得到目的蛋白。由于重組N-脫氧核糖轉移酶II的N端連接一段約2 kD的His標簽，故重組酶蛋白的大小在20 kD左右，SDS-PAGE圖中目的條帶位置與預測的一致。

圖3 重組NDT的SDS-PAGE檢測

另外，在OD600的條件下，菌體密度測定的結果（圖4）表明，加入0.1 mmol/L 的IPTG之后，菌體量的增長也會受到抑制。BN菌株在兩種誘導培養基中誘導4 h后，自誘導培養基中的菌體密度明顯高于LB誘導系統，在誘導結束后，NDT酶的總含量也有相應的提高（圖3）。

圖 4 兩種誘導途徑的菌體生長曲線

2.3 N-脫氧核糖轉移酶II的活性測定

為計算產物的轉化率，測定了2’-脫氧胞苷標準樣的質量與HPLC圖譜峰面積之間的關系，制定了標準曲線（圖5）。為了測定酶是否具有催化活性，利用標準反應體系在30℃條件下反應15 min后，對反應樣品進行HPLC檢測，結果（圖6）表明含有NDT的完整細胞能夠成功催化2’-脫氧胞苷的合成。

圖5 2’-脫氧胞苷（dCyd）的標準曲線

圖6 表明NDT催化活性的具有代表性的HPLC圖譜

此外，本試驗還測定了不同量的菌體對產物生成率的影響，結果（圖7-A）表明誘導后的重組細胞具有很高的催化活性，1 mg/mL的菌體量就足以快速催化產物的合成，而菌體用量越多，雜酶的含量也相應增多，從而引發更多的副反應，導致產物量隨著反應時間的延長而下降。對比兩種誘導途徑得到的相同的菌體量對產物轉化率的影響（圖7-B和圖7-C），并對各個時間點的兩組平行數據進行方差分析和T檢驗，統計學分析的結果顯示兩組數據在0.05水平上不具備顯著性差異，表明自誘導培養途徑得到的完整菌體與傳統培養基誘導得到的菌體具有同樣高效的催化活性。

2.4 合成2-脫氧胞苷的催化條件的優化

2.4.1 反應溫度對產物轉化率的影響 試驗測定了不同反應溫度對催化合成2’-脫氧胞苷的影響，反應1 h后的結果（圖8-A）表明，在30℃反應條件下，產物轉化率較高且產物量相對比較穩定。

2.4.2 緩沖液pH對產物轉化率的影響 不同酸堿度的緩沖液的影響（圖8-B）表明，構建得到的全菌體在弱酸性條件下的催化活性較高，即pH為6.5的條件下能夠獲得較高的產物轉化率。

2.4.3 底物濃度比對產物轉化率的影響 測定兩種底物濃度比的影響（圖8-C）表明，兩種底物間濃度比越大，產物的轉化率越高，當脫氧胸苷∶胞嘧啶為1∶3時，2’-脫氧胞苷的轉化率可高達86.5%。

3 討論

本試驗通過分子生物學手段構建得到含有NDT的重組菌株，用于高效一步反應催化合成2’-脫氧胞苷（dCyd）。構建菌株的誘導表達采用了兩種不同的誘導培養系統：傳統LB培養基加IPTG和ZYMFe-5052自誘導系統，其中自誘導培養基由于含有少量的甘油及FeCl3等成分，有利于獲得更高的菌體密度及目的酶量［22］。同時，α-乳糖作為誘導劑，其價格和毒性均低于IPTG。

本研究是首次采用自誘導培養基對含有NDT的重組菌體進行誘導，并用誘導后的完整菌體催化合成dCyd。相關結果表明，試驗構建的表達菌株能夠高效催化底物轉化為目的產物，但產物量會隨反應時間的延長有所降低，原因可能是表達菌株內固有

的轉氨酶催化目的產物發生了分解反應，且轉氨酶在60℃條件下的活性較高，但在30℃條件下其活性可以被有效抑制［26］。降低表達菌株中固有酶對催化反應的影響，是很值得后續研究的方面，以便于在核苷類似物的工業化生產過程中獲得穩定的產物量。

圖7 不同菌量及兩種誘導途徑對產物轉化率的影響

圖8 不同反應條件對產物轉化率的影響

試驗測定了不同反應條件對產物轉化率的影響，結果表明重組酶具有很高的催化活性，能夠在短時間內達到較高產率。綜合考慮經濟因素和產物轉化率，認為脫氧胸苷∶胞嘧啶為1∶1.5時為較適宜的底物濃度比。此濃度比與1∶1相比，底物中增加了15 mmol/L的胞嘧啶，但底物仍能夠很好的溶解，而且胞嘧啶價格低于胸腺嘧啶，此濃度比與1.5∶1條

件下的產物生成率相當；而與1∶2相比，第2次增加15 mmol/L的胞嘧啶對產物轉化率的提升相對較小；當濃度比為1∶3時，胞嘧啶不能較好地溶解，底物浪費程度高。依據結果，合成2’-脫氧胞苷適宜的反應條件為：30 mmol/L的脫氧胸苷和45 mmol/L的胞嘧啶，溶解于pH6.5的磷酸緩沖液中，加入1 mg/mL BN完整細胞在30℃條件下反應1 h，產物轉化率可達71.9%。

到目前為止，自誘導培養基在酶蛋白的過量表達方面使用較少，所以本研究可以為自誘導培養基的廣泛應用提供研究基礎。此方法的優點在于無需在培養過程中額外添加誘導劑，簡化了誘導培養的過程，減少了污染的可能性；乳糖作為誘導劑，其價格和毒性都低于IPTG；使用全菌體進行反應，省去了蛋白純化的過程；自誘導培養系統還能夠獲得更高的菌體密度及目的蛋白量，且此方法獲得的全菌體與傳統誘導途徑得到菌體的催化活性同樣高效，故更適宜應用于核苷類似物的大規模生產過程。本試驗還利用重組BN完整細胞成功催化5-雜氮-2’-脫氧胞苷的合成，表明此重組細胞及誘導方法適用于多種核苷類似物的合成，因此具有很大的應用價值及前景。

4 結論

本研究構建含有NDT酶的全菌體用于高效催化合成2’-脫氧胞苷。試驗采用的自誘導方法操作簡便，無需額外添加誘導劑；與傳統LB誘導方法相比，在培養相同時間后，能夠獲得更高的菌體量及目的蛋白量，并且相同菌體量的催化能力相似，為自誘導培養基的進一步應用提供了研究基礎。

［1］Mikhailopulo IA, Miroshnikov AI. New trends in nucleoside Biotechnology［J］. Acta Naturae, 2010, 2：36-58.

［2］嚴琳, 孔軍, 侯莉莉.核苷類似物的設計合成及其抗腫瘤活性［J］.河南大學學報：自然科學版, 2011, 41（3）：257-261.

［3］Galmarini CM, Mackey JR, Dumontet C. Nucleoside analogues and nucleobases in cancer treatment［J］. Lancet Oncol, 2002, 3：415-424.

［4］Mathe C, Gosselin G. L-nucleoside enantiomers as antivirals drugs： a mini-review［J］. Antivir Res, 2006, 71：276-281.

［5］Zhang J, Visser F, King KM, et al. The role of nucleoside transporters in cancer chemotherapy with nucleoside drugs［J］. Cancer Metast Rev, 2007, 26：85-110.

［6］Zou Z, Ding Q, Ou L, Yan B. Efficient production of deoxynucleoside-5’-monophosphates using deoxynucleoside kinase coupled with a GTP-regeneration system［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97：9389-9395.

［7］徐淵, 王鴻, 易喻, 等.核苷合成技術的研究進展［J］.化工生產與技術, 2009, 16（2）：32-39.

［8］王麗慧, 丁慶豹, 歐伶, 等.酶法合成5-雜氮-2’-脫氧胞苷［J］.華東理工大學學報：自然科學報, 2011, 37（7）：325-329.

［9］樊華偉, 傅紹軍, 邵志宇, 朱利民.核苷類藥物酶法合成研究進展［J］.生物技術通訊, 2005, 16（6）：690-692.

［10］邱蔚然, 丁慶豹.酶法合成核苷類抗病毒藥物［J］.中國醫藥工業雜志, 1999, 30（10）：474-478.

［11］Macnutt WS. The enzymically catalysed transfer of the deoxyribosyl group from one purine or pyrimidine to another［J］. Biochem J, 1951, 50：384-397.

［12］Holguin J, Cardinaud R. Trans-N-Deoxyribosylase：Purification by affinity chromatography and characterization［J］. Eur J Biochem, 1975, 54：505-514.

［13］Holguin J, Cardinaud R. Trans-N-Deoxyribosylase：Substrate specificity studies purine bases as acceptors［J］. Eur J Biochem, 1975, 54：515-520.

［14］Kaminski PA. Functional cloning, heterologous expression, and purification of two different N-deoxyribosyltransferases from Lactobacillus helveticus［J］. J Biol Chem, 2002, 277：14400-14407.

［15］Carson DA, Wasson DB. Synthesis of 2’, 3’-dideoxynucleosides by enzymatic trans-glycosylation［J］. Biochem Bioph Res Co, 1988, 155：829-834.

［16］Freeman GA, Shaver SR, Rideout JL, Short SA. 2-amino-9-（3-azido-2, 3-dideoxy-β-D- erythro-pentofuranosyl）-6-substituted-9H-purines：Synthesis and anti-HIV activity［J］. Bioorgan Med Chem, 1995, 3：447-458.

［17］Anand R, Kaminski PA, Ealick SE. Structures of purine 2￠-Deoxyribosyltransferase, substrate complexes, and the ribosylated enzyme intermediate at 2.0 ? resolution［J］. Biochemistry, 2004, 43：2384-2393.

［18］Kiyoshi O, Toshitada N. Molecular cloning and expression of the nucleoside deoxyribosyltransferase-II Gene from lactobacillus helveticus［J］. Biosci Biotechnol Biochem, 2000, 64：2243-2245.

［19］Gombert AK, Kilikian BV. Recombinant gene expression in Escherichia colicultivation using lactose as inducer［J］. J Biotechnol, 1998, 60：47-54.

［20］Donovan RS, Robinson CW, Glick BR. Review：Optimizing inducer and culture conditions for expression of foreign proteins under the control of the lac promoter［J］. J Ind Microbiol, 1996, 16：145-154.

［21］Neubauer P, Hofmann K, Holst O, et al. Maximizing the expression of a recombinant gene in Escherichia coli by manipulation of induction time using lactose as inducer［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 1992, 36：739-744.

［22］Studier FW. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures［J］. Protein Expres Purif, 2005, 41：207-234.

［23］Xiong J, Zhang W, Su J, et al. Improved synthesis of 2’-deoxyadenosine and 5-methyluridine by Escherichia coli using an auto-induction system［J］. World J Microbiol Biotechnol, 2012, 28：721-727.

［24］Lin Y, Zhang W, Zhu F, et al. Subcellular localization of N-deoxyribosyltransferase in Lactobacillus fermentum：cell surface association of an intracellular nucleotide metabolic enzyme［J］. FEMS Microbiol Lett, 2011, 323：132-141.

［25］Fernandez-Lucas J, Acebal C, Sinisterra JV, et al. Lactobacillus reuteri 2’-deoxyribosyltransferase, a novel biocatalyst for tailoring of nucleosides［J］. Appl Environ Microb, 2010, 76：1462-1470.

［26］Britos CN, Cappa VA, Rivero CW, et al. Biotransformation of halogenated 2’-deoxyribosides by immobilized lactic acid bacteria［J］. J Mol Catal B-Enzym, 2012, 79：49-53.

（責任編輯 馬鑫）

Application of Auto-induction System in the Synthesis of 2’-deoxycytidine

Wang Xi1Duan Shenglin2Xiong Shuli1Zheng Guilan1Zhang Guiyou1Wang Hongzhong1
（1. School of Life Sciences，Tsinghua University，Beijing 100084；2. China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100015）

This experiment was carried out in order to synthesize 2’-deoxycytidine（dCyd）more efficiently. DCyd is a significant intermediate for many antiviral and anticancer drugs such as Gemcitabine（dFdC）, Dideoxycytidine（ddC）, etc. A convenient and efficient bioprocess was reported here to synthesize dCyd by E.coli BL21（DE3）containing gene of N-deoxyribosyltransferaseⅡ（NDT）overexpressed using ZYM-Fe-5052 auto-induction system. The results showed that auto-induction system could make the addition of inducer during cultivation unnecessary and obtain a higher cell density. The recombinant cells from auto-induction system were as efficient as that from LB system on the conversion yields of dCyd. When the ratio of 2’-deoxythymidine（dThd）and cytosine was 1∶3, the conversion yield could be 86.5%. The substrates ratio of 2’-deoxythymidine (dThd) and cytosine as 1∶1.5 and 1 mg/mL recombinant cells which were dissolved in phosphate buffer of pH6.5, then cultured at 30℃ for 1 h were selected as the suitable reaction conditions，and the conversion yield could be 71.9%. This method also has potential for the preparation of other nucleoside analogues.

Biocatalysis N-deoxyribosyltransferase 2’-deoxycytidine Auto-induction system Nucleoside analogues

2014-03-31

國家自然科學基金項目（21176138），國家自然科學基金國家基礎科學人才培養基金項目（J1103506，J1030622，J1310020）

王璽，女，碩士，研究方向：生物轉化及生物催化；E-mail：wangxi1822@163.com

王洪鐘，男，博士，副教授，研究方向：生物轉化及生物催化；E-mail：hzwang@mail.tsinghua.edu.cn