基因組編輯技術(shù)研究進(jìn)展

吳璐 王磊 任遠(yuǎn) 原輝

（深圳華大基因研究院，深圳 518083）

基因組編輯技術(shù)研究進(jìn)展

吳璐 王磊 任遠(yuǎn) 原輝

（深圳華大基因研究院，深圳 518083）

利用基因組編輯技術(shù)可以對生物基因組特定位點(diǎn)進(jìn)行人工修飾，研究相關(guān)基因的功能，進(jìn)而應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床治療方面。序列特異性的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與非特異性的DNA修飾結(jié)構(gòu)域組合而成的人工酶是基因組編輯工具的重要組成部分。主要介紹了鋅指核酸酶（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）、歸巢核酸內(nèi)切酶（Meganucleases）和成簇間隔短回文重復(fù)（CRISPR）4種基因組編輯技術(shù)的特點(diǎn)、原理、構(gòu)建方法及應(yīng)用，為相關(guān)的研究和應(yīng)用提供參考。

基因編輯 ZFNs TALEN CRISPR 同源重組

基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)對一個(gè)或多個(gè)目的基因的敲除，或是把外源基因敲入到指定位點(diǎn)，也可以利用轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平上對目的基因的表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控，這項(xiàng)技術(shù)是研究基因功能并對基因的功能加以利用的最有效手段。

基因組定點(diǎn)編輯工具主要有鋅指核酸酶（Zincfinger nucleases，ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN）、歸巢核酸內(nèi)切酶（Meganucleases）和成簇間隔短回文重復(fù)（The type II clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR），以上工具均可以對基因組進(jìn)行精確的定點(diǎn)修飾，工作原理基于核酸內(nèi)切酶在基因組的特定位點(diǎn)進(jìn)行切割，從而形成DNA雙鏈斷裂（Double strand break，DSB）。細(xì)胞中存在天然的DNA損傷應(yīng)答機(jī)制，DSB會(huì)被同源重組

修復(fù)（Homology directed recombination repair，HDR）和非同源末端連接（Non-homologous end joining，NHEJ）兩種方式修復(fù)。在同源序列（外源引入或同源染色體）存在的情況下，同源重組修復(fù)（HDR）可實(shí)現(xiàn)外源基因的插入或基因的靶向修復(fù)；在沒有同源序列的情況下，細(xì)胞趨向于利用非同源的末端連接（NHEJ）進(jìn)行DNA的修復(fù)，它可能引入或刪除一個(gè)或多個(gè)堿基從而造成基因移碼突變，使相關(guān)基因被敲除。4種基因組編輯技術(shù)的序列靶向識別、人工構(gòu)建方法等均有很大不同。

1 鋅指核酸酶（ZFNs）

ZFN是一種人工改造的核酸內(nèi)切酶，它由特異性的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和非特異性的切割域兩部分構(gòu)成，其中結(jié)合域由一系列串聯(lián)的具有Cys2-His2結(jié)構(gòu)的鋅指蛋白構(gòu)成，切割域主要是指核酸內(nèi)切酶

Fok I。在基因組靶標(biāo)位點(diǎn)左右兩邊各設(shè)計(jì)一個(gè)ZFN（分別根據(jù)正負(fù)鏈的序列），識別結(jié)構(gòu)域?qū)蓚€(gè)ZFN結(jié)合到基因組特定位點(diǎn)，當(dāng)兩個(gè)識別位點(diǎn)的間距為6-8 bp時(shí)，兩個(gè)Fok I單體相互作用形成二聚體，行使酶切功能對靶標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行切割，從而實(shí)現(xiàn)基因修飾的目的［1，2］（圖1）。

鋅指蛋白源自轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族，在真核生物中廣泛存在，其骨架結(jié)構(gòu)保守，每個(gè)鋅指蛋白能夠識別特定3 bp長的DNA序列，早期的研究中多采用左右兩邊各3個(gè)鋅指蛋白來識別總共18 bp的序列（3×3×2），也有的構(gòu)建方法增加鋅指蛋白數(shù)目到左右兩邊各6個(gè)，從而增強(qiáng)識別特異性［3］（圖1）。

圖1 ZFN作用原理示意圖

ZFN的構(gòu)建方法主要有3種：直接組裝法、篩選法和商業(yè)定制法。直接組裝法基于鋅指蛋白和堿基間的識別對應(yīng)關(guān)系，直接按照目的序列選擇鋅指進(jìn)行組裝，這個(gè)方法簡單易行，但識別效率較低，目前經(jīng)典的方法主要有MA法（Modular assembly）和CoMA法（Context-dependent assembly）［4-6］。篩選法的思想是采用一步或多步的篩選策略，以O(shè)PEN法（Oligomerized pool engineering）為代表，首先構(gòu)建一個(gè)待篩選的鋅指庫，而后篩選出特異性高的鋅指進(jìn)行下一步的組裝，工作量較大，但是效率較高［7］。Sangamo公司成功對ZFN技術(shù)進(jìn)行了商業(yè)推廣，直接從該公司訂購的ZFN表達(dá)載體可保證打靶的質(zhì)量和效率。

2 轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）

TALEN是人工改造的核酸內(nèi)切酶，也是由特異性的結(jié)合域和非特異性的切割域共兩部分構(gòu)成，其中切割域和鋅指核酸酶的切割域類似，均為Fok I內(nèi)切酶；TALEN 的結(jié)合域是經(jīng)過人工改造的TALE蛋白，這種蛋白最初來源于一種植物病原菌——黃單胞桿菌（Xanthomonas）。與鋅指核酸酶類似，也是根據(jù)靶標(biāo)位點(diǎn)兩側(cè)的序列設(shè)計(jì)一對TALEN，結(jié)合到對應(yīng)的識別位點(diǎn)后，兩個(gè)Fok I單體相互作用形成二聚體，對靶標(biāo)序列進(jìn)行切割，實(shí)現(xiàn)基因修飾的目的［8］。

TALEN系統(tǒng)中，除去N端和C端序列的中間區(qū)域包含一系列的長度為34個(gè)氨基酸的重復(fù)單元（Monomers），該重復(fù)單元為TALEN系統(tǒng)識別和結(jié)合的基本單位。自然界發(fā)現(xiàn)的TALE蛋白包含的monomers個(gè)數(shù)從1.5到33.5不等，每個(gè)monomer的序列高度保守，但是在第12位和13位的兩個(gè)氨基酸是可變的，稱之為RVD（Repeat variable diresidues）［9］。研究發(fā)現(xiàn)了RVD和其所識別堿基的一一對應(yīng)關(guān)系，其中NI識別A，HD識別C，NG識別T，NN識別G或是A（圖2）。不同的monomers和不同的排列順序即可決定識別不同的DNA序列。在植物基因組中，原始的TALE識別序列一般從T開始，推測是由TALE的N端序列來識別的。此外，TALEN的結(jié)合域一般以半個(gè)monomers的重復(fù)結(jié)束。因此，TALEN識別的DNA序列包含首端的一個(gè)T堿基、中間的多個(gè)RVDs識別的堿基、末端半個(gè)monomers識別的一個(gè)堿基。另外TALE識別DNA序列具有方向性，從DNA的5'到3'［10］。

圖2 TALEN結(jié)構(gòu)示意圖

由于TALEN中存在多個(gè)重復(fù)序列，所以通過傳統(tǒng)分子克隆和人工合成等方法并不能進(jìn)行有效地組裝。目前已開發(fā)出了多種方便快捷的組裝方法，如Golden-Gate組裝、順序組裝和高通量固相組裝。應(yīng)用最廣泛的是Golden-Gate組裝方法，它的核心策略是采用ⅡS型限制性內(nèi)切酶和T4連接酶同時(shí)進(jìn)行酶切和連接。ⅡS型內(nèi)切酶的特點(diǎn)是切割位點(diǎn)位于識別位點(diǎn)之外，例如，Bsa I識別位點(diǎn)為GGTCTC，而

切割模式則是GGTCTCN^NNNN。在酶切連接的過程，每個(gè)片段兩端均設(shè)計(jì)上ⅡS型酶的識別序列來產(chǎn)生需要的粘性末端，在連接酶的作用下與含有互補(bǔ)粘性末端的片段連接，達(dá)到片段延伸的效果，而ⅡS型內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)則在酶切過程中被消除。優(yōu)化的Golden Gate組裝便捷度更是得到提升，可在1 d內(nèi)完成組裝［11，12］。順序組裝的方法在一定程度上借鑒合成生物學(xué)的Bio-Brick的思想，即利用限制性內(nèi)切酶處理后將每個(gè)模塊一步一步連接而成［13］。盡管這種方法大大簡化了TALEN的構(gòu)建，但仍需要一定的時(shí)間和工作量投入，這造成無法批量生產(chǎn)TALEN，而FLASH技術(shù)則可以實(shí)現(xiàn)批量化生產(chǎn)。FLASH主要采用固相策略來對TALE的單元片段進(jìn)行連接，按照所需的monomers的連接順序，重復(fù)性地進(jìn)行片段連接和洗滌，最終的連接產(chǎn)物則通過限制性消化而從固相中釋放出來，而后通過亞克隆連接到表達(dá)載體上，完成TALEN的構(gòu)建［14］。

在人、小鼠、斑馬魚、大鼠、豬等動(dòng)物和擬南芥、水稻、煙草等植物［10，13，15-18］中成功驗(yàn)證了TALEN對基因組進(jìn)行編輯的有效性，在這些研究中實(shí)現(xiàn)了目的基因的敲除、外源基因的定點(diǎn)插入、基因組大片段刪除（利用兩對TALEN）和基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控（用轉(zhuǎn)錄因子替代FokⅠ內(nèi)切酶）［19］。2014年中國科學(xué)家成功利用TALEN技術(shù)對食蟹猴進(jìn)行了基因敲除，這是利用這項(xiàng)技術(shù)構(gòu)建出的首個(gè)非人類靈長類動(dòng)物模型［20］。

在疾病治療方面，報(bào)道了利用TALEN技術(shù)對誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS）的突變基因進(jìn)行了人工修復(fù)，也有研究證明這項(xiàng)技術(shù)可應(yīng)用于線粒體基因突變的修復(fù)工作，這些研究都為TALEN的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)［21］。Y染色體結(jié)構(gòu)的特殊性使得對Y染色體的研究相對滯后，TALEN技術(shù)成功地實(shí)現(xiàn)了對小鼠Y染色體的基因修飾，可作為研究哺乳動(dòng)物Y染色體的有效工具［22］。TALEN技術(shù)也可以用來研究miRNA，敲除目標(biāo)miRNA在染色體上的對應(yīng)序列，從而研究其生物學(xué)功能［23］。

3 歸巢核酸內(nèi)切酶

歸巢核酸內(nèi)切酶也是一種工程化的內(nèi)切酶，它可識別的位點(diǎn)序列較長，從12 bp到40 bp不等。應(yīng)用最廣泛的是LAGLIDADG家族，它廣泛地存在于真核生物的線粒體和葉綠體中，常見的有I-SceI、I-CreI和I-DmoI，其家族成員在結(jié)構(gòu)上具有一定的保守性，均包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和酶切活性結(jié)構(gòu)域［24］。這項(xiàng)技術(shù)早在1990年就被應(yīng)用于基因修飾，天然存在的歸巢核酸內(nèi)切酶具有高特異性和低細(xì)胞毒性的特點(diǎn)，局限性在于已知的歸巢核酸內(nèi)切酶的種類有限，識別的DNA序列也有限。工程化的歸巢核酸內(nèi)切酶是利用生物技術(shù)的手段，通過在天然存在的歸巢核酸內(nèi)切酶上引入一定數(shù)量的其他氨基酸序列，或是將不同的識別結(jié)構(gòu)域進(jìn)行融合，從而實(shí)現(xiàn)識別DNA序列的目的［25］。目前歸巢核酸內(nèi)切酶技術(shù)的研發(fā)和應(yīng)用主要集中在某些較大的生物公司，如Cellestis和Bayer Crop Science。研究表明工程化歸巢核酸內(nèi)切酶可應(yīng)用于玉米基因組的修飾［26］。在基因治療方面，有成功應(yīng)用于修復(fù)著色性干皮病的報(bào)道［27］。

4 成簇間隔短回文重復(fù)（CRISPR）

CRISPR是一種RNA誘導(dǎo)的獲得性免疫系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌和古生菌中，用來抵抗外來病毒或是質(zhì)粒的入侵。該系統(tǒng)由成簇間隔的短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences） 和Cas基 因（CRISPR-associated genes）組成。CRISPR/Cas系統(tǒng)首先產(chǎn)生與靶標(biāo)序列對應(yīng)的RNA序列，與病毒或質(zhì)粒的DNA進(jìn)行互補(bǔ)作用，然后引導(dǎo)Cas內(nèi)切酶對互補(bǔ)的序列進(jìn)行雙鏈切割［28］。其中Cas基因家族中的Cas9廣泛地應(yīng)用于該系統(tǒng)中，它是一種天然存在的內(nèi)切酶，具有兩個(gè)酶切活性結(jié)構(gòu)域：HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域和Ruv-C-like結(jié)構(gòu)域，分別切割互補(bǔ)鏈和非互補(bǔ)鏈。切割過程需要另外兩個(gè)RNA的幫助，分別為CRISPR RNA（crRNA）和反式CRISPR RNA（trans -acting CRISPR RNA，tracrRNA），人們已經(jīng)將這兩種RNA改造融合成一個(gè)向?qū)NA（single-guide RNA，sgRNA），單個(gè)sgRNA足以幫助Cas9實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)切割的效果［29］（圖3）。

經(jīng)過人工改造的CRISPR/Cas系統(tǒng)一般分為兩種，一種主要由Cas9、tracrRNA和crRNA三部分構(gòu)成；另一種主要由Cas9和sgRNA兩部分構(gòu)成。載

體的構(gòu)建過程簡便快捷，僅需人工合成一段和靶標(biāo)序列相同的序列，連接至載體特定位點(diǎn)即可，具有高通量高效率的特點(diǎn)［30］。

圖3 人工改造CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用原理示意圖

2013 年，Science等雜志報(bào)道了CRISPR技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用，該技術(shù)迅速成為分子生物學(xué)研究熱點(diǎn)［29，30］。接下來的研究集中在CRISPR技術(shù)在不同的生物中的應(yīng)用，在大腸桿菌、酵母、水稻、擬南芥、煙草、斑馬魚、人、小鼠和豬等生物中都成功驗(yàn)證了這項(xiàng)技術(shù)的功能性，涵蓋單基因敲除、外源基因插入、基因靶向修復(fù)、多基因敲除、大片段敲除和調(diào)控基因表達(dá)等［30-39］。南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所利用CIRSPR技術(shù)對食蟹猴基因組進(jìn)行了修飾，這是人類首次將基因編輯技術(shù)應(yīng)用在靈長類動(dòng)物中，這對人類遺傳性疾病的基因治療具有里程碑式的意義［40］。

CRISPR/Cas載體的構(gòu)建具有高通量高效率的特點(diǎn)。英國洛桑研究所構(gòu)建了小鼠基因組導(dǎo)向RNAs文庫，可靶向基因組中的絕大多數(shù)基因［41］。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了針對人類基因組的sgRNA文庫，sgRNAs數(shù)量分別為73 000和64 751，實(shí)現(xiàn)了基因組編輯技術(shù)在人全基因水平上的應(yīng)用［42，43］。

CRISPR/Cas技術(shù)的局限性在于存在一定的脫靶現(xiàn)象。多個(gè)實(shí)驗(yàn)室首先報(bào)道了CRISPR系統(tǒng)的脫靶現(xiàn)象，sgRNA與DNA互補(bǔ)配對時(shí)，在某些位置上允許1個(gè)或兩個(gè)的堿基不配對，甚至?xí)嬖?個(gè)堿基不配對的情況［44-46］。這在一定程度上打擊了科學(xué)家們將CRISPR技術(shù)應(yīng)用于醫(yī)療臨床的積極性。CRISPR技術(shù)最初的開發(fā)者張峰帶領(lǐng)的實(shí)驗(yàn)室利用一對sgRNA來識別靶標(biāo)位點(diǎn)，大大降低了脫靶效率［47］。南京大學(xué)黃興許課題組也是利用Cas9切口酶和成對sgRNA大大降低CRISPR系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)［48］。

5 總結(jié)及展望

以上介紹的基因編輯技術(shù)都是采用內(nèi)切酶在DNA上打開缺口，然后利用細(xì)胞內(nèi)自有的修復(fù)機(jī)制來實(shí)現(xiàn)基因編輯，但每種基因編輯工具都各有特點(diǎn)，總結(jié)歸類如表1所示。

表1 不同基因組編輯技術(shù)比較

有效地提高特異性、減少脫靶率是基因組編輯技術(shù)應(yīng)用于臨床治療的最核心問題，可利用生物信息學(xué)的方法盡量選擇在基因組上無同源或相似性序列的位點(diǎn)，以減少脫靶效率。需要指出的是，不同基因組編輯技術(shù)對不同序列的識別效率存在一定

的差異，原因可能與染色體的結(jié)構(gòu)和不同技術(shù)的識別機(jī)制有關(guān)，例如，在TALEN系統(tǒng)識別切割過程中，染色體的狀態(tài)可能會(huì)影響兩個(gè)TALE間的距離，從而影響了左右兩個(gè)Fok I形成二聚體的效率，在CRISPR識別過程中，高G+C含量可能會(huì)使gRNA與DNA互補(bǔ)配對更穩(wěn)定，從而提高切割效率。

對基因組編輯技術(shù)的優(yōu)化改造是當(dāng)下研究的熱點(diǎn)，對于ZFN、TALEN和CRISPR三種技術(shù)來講，一部分研究集中在優(yōu)化保守性切割域：Fok I和Cas9。利用優(yōu)化后的Fok I、TALEN元件的C端和N端以及TALE和Fok I的linker，可提高打靶效率［15］。對于來源于S. spyogenes的Cas9，目前已經(jīng)有其突變型D10A用于產(chǎn)生單鏈缺口而不是雙鏈斷裂［47］。對于Cas9的另一個(gè)問題是其編碼序列較大，后續(xù)研究有望進(jìn)一步簡化Cas9序列或是找出其同源的內(nèi)切酶，以期提高轉(zhuǎn)染效率和切割特異性。

基因編輯工具對于基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用均有重大意義。早期經(jīng)典的突變技術(shù)及同源重組技術(shù)為反向遺傳學(xué)的研究做出了重大貢獻(xiàn)，新一輪的ZFN、TALEN、CRISPR等技術(shù)使基因敲除和插入技術(shù)變得更為簡便快捷，這對研究基因功能非常重要。在疾病模型方面，很多單基因疾病的研究尚未建立小鼠疾病模型，利用基因編輯技術(shù)在小鼠胚胎干細(xì)胞中進(jìn)行單基因敲除，進(jìn)而得到基因敲除小鼠，這對研究單基因疾病非常重要，是進(jìn)行病理學(xué)研究和藥物篩選的基礎(chǔ)；在動(dòng)植物育種方面，利用基因敲除技術(shù)可以得到某特定基因敲除的動(dòng)植物，獲得特定的性狀。例如，敲除myostain基因后可獲得肌肉量增多的牛品種［49］。也可利用基因插入技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，如乳腺反應(yīng)器，將某些藥物蛋白敲入到牛或羊的β-catenin啟動(dòng)子下，得到可在乳汁中分泌藥物蛋白的動(dòng)物個(gè)體；在疾病治療方面，利用基因編輯技術(shù)對疾病相關(guān)的基因突變進(jìn)行靶向修復(fù)，進(jìn)而達(dá)到基因治療的目的。總之對于基因的研究離不開基因組編輯技術(shù)，基因組編輯技術(shù)的不斷更新發(fā)展是必然的趨勢。

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（責(zé)任編輯 李楠）

The Research of Genome Editing

Wu Lu Wang Lei Ren Yuan Yuan Hui
（BGI-Shenzhen，Shenzhen 518083）

Genome Editing can be used to operate artificially almost any gene in cells or organisms. This research method of gene function is useful for fundamental research and clinic treatment. The major component of this tool is artificial nuclease with specific DNA-binding domain and non-specific DNA-modifying domain. This article reviews the characteristics, principle, construction and application of ZFN, TALEN and CRISPR/Cas, which would be useful reference for related research.

Gene editing ZFNs TALEN CRISPR Homologous recombination

2014-01-26

深圳市戰(zhàn)略新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)資金項(xiàng)目（CXZZ20120615141322654）

吳璐，女，碩士，研究方向：分子生物學(xué)；E-mail：wulu@genomics.cn

原輝，男，博士，研究方向：動(dòng)植物分子育種；E-mail：yuanhui@ genomics.cn