普通野生稻miR160f的克隆和功能分析

楊松楠王姣陳宗祥田新杰張靜文龍艷裴新梧袁潛華

（1. 海南大學農學院，海口 570228；2. 中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081）

普通野生稻miR160f的克隆和功能分析

楊松楠1王姣2陳宗祥2田新杰1張靜文2龍艷2裴新梧2袁潛華1

（1. 海南大學農學院，海口 570228；2. 中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081）

MicroRNAs是一類在調節基因轉錄后表達中起重要作用的非編碼RNA。miR160通過調節生長素響應因子（ARF）參與根細胞的分裂和分化，從而影響根的發育。克隆了普通野生稻miR160f基因，并將其轉入擬南芥中鑒定功能。結果表明，過表達miR160f的擬南芥蓮座葉的數量減少，抽薹時間縮短，開花的時間提前。qPCR檢測顯示miR160f的靶基因ARF10、ARF16及ARF17在過表達擬南芥植株中的表達下調，而ARF10和ARF16蛋白的缺失或減少會導致根冠細胞分化受阻、分裂失控，并導致根尖干細胞群的異位擴大，因此可以表明miR160不僅影響根的發育，還可能與水稻的開花時間相關。

miRNA 花期 普通野生稻 擬南芥 表達載體

MicroRNAs是一類短的非編碼單鏈RNAs，長度范圍在16-29 nt，以20-21 nt居多［1］，最早發現于線蟲C.elegans中，廣泛存在于動植物和一些病毒中［2］。越來越多的證據顯示miRNA在許多生物的代謝過程中起重要作用，包括組織識別、發育時序調控、對環境脅迫的應答等［3］。然而，miRNA并不直接控制植物的生長和發育，其功能是通過對它所作用的靶基因mRNA的切割或抑制蛋白翻譯實現［4］。miRNA參與植物開花及花器官發育，與植物激素信號傳導、葉片發育、植物組織器官形態改變、營養脅迫、抗逆境脅迫等多種因素相關［5］。

普通野生稻（O. rufipogon）被認為是亞洲栽培

稻（O. sativa）的祖先種，廣泛分布于中國、東南亞和南亞地區。其中，中國南方地區是普通野生稻的發源地之一，具有豐富的遺傳多樣性和多種優良特性，是栽培稻遺傳改良的寶貴資源［6］。目前，對栽培稻miRNA的克隆與功能驗證已有許多報道，但對普通野生稻miRNA的研究報道較少［7，8］。其中miR160家族與植物生長素信號有關，植物生長素誘導的轉錄通過植物生長素響應因子（ARF）促成側根的發育，因此miR160家族對側根的起始和種子的發育起調節作用，其家族包括眾多成員，如 miR160a，b，c，d，e，f，g，h，i，m，n，o。Mallory等［9］證實，中斷miR160的轉錄，其靶基因ARF10、ARF16、ARF17 mRNA 的表達水平均有增加，從而改變生長素誘導因子GH3-like基因的表達，并影響另一生長素效應因子DR5的正常功能，導致植株的發育受到嚴重影響，如產生鋸齒狀葉片或卷縮狀葉片，花形態改變和可育性降低等。Kantar等［10］的研究結果表明，擬南芥miR160的靶基因是ARF10、16和17，其中ARF10和16共同參與了根冠細胞的分化，并在根冠處特異表達［11］。在地上部分，miR-160通過對3個靶基因負調控，參與了生長素初始應答基因的表達調控，促進了細胞的分裂和增大［12］。在對水稻的研究中發現，轉基因miR160a植株在ABA的處理下其幼苗根部生長受到抑制，而且從孕穗期開始，轉基因植株的分蘗角度增大，株型發生改變［13］。在普通野生稻中，還沒有相關miR160的研究，本研究克隆普通野生稻中的miR160f，構建過表達載體轉化擬南芥，并進行功能分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 植物表達載體構建與農桿菌轉化 根據本實驗室前期構建的廣東高州普通野生稻sRNA文庫中的miR160f莖環前體序列［8］，以miR160f莖環前體為中心的基因組DNA序列為模板，設計帶酶切位點Bgl（GAAGATCTTC）的上游引物和BstEⅡ（GGGTTACCC）的下游引物（上游引物：GAAGATCTTCGGATTAACGCTGCCTGGCTCC，下游引物：GGGTTACCCGAGCAAACCCTGCATGACTC）。以提取的普通野生稻葉片DNA為模板克隆得到165 bp的片段pre-miR160f。通過測序驗證后再克隆到表達載體pCAMBIA3301上，命名為：pmiR160f-bar。利用花序浸染法轉化擬南芥，浸染后的擬南芥收取種子后，播種于含50 μg/mL Bialaphos Sodium Salt的MS選擇培養基用于篩選轉基因植株。對T2代植株進行形態學觀察。

1.2.2 轉基因擬南芥分子檢測 提取野生型及轉基因擬南芥基因組DNA，設計bar基因的引物（上游引物：TCAAATTCTCGGTGACGGGCA，下游引物：ATGAGCCCAGAACGACGCCC），檢測表達載體是否轉入擬南芥中。為了進一步證實轉基因植株中miR160f成熟體是否表達，設計莖環RT反向引物（CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCCGGCAATTCAGTT GAGTGGCATTC）進行RNA反轉錄，再利用miR160f上游引物（ACACTCCAGCTGGGTGCCTGGCTC）和下游引物（AACTGGTGTCGTGGAG）進行miR160f成熟體的擴增。成熟體莖環RT-PCR步驟參照Feng等［14］，擴增產物在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 轉基因擬南芥植株的表型觀察 經選擇培養基篩選存活的T1代陽性植株收取種子，與野生型種子同時播種在營養土中于光照16 h/黑暗8 h、光照強度為180 μmol/ （m2·s）、溫度為22℃、相對濕度為70%的條件下進行培養。轉基因植株和野生型植株各選取32株進行表型觀察，并對首次抽薹時間、首次抽薹時蓮座葉的數目及首次開花時的植株高度作統計分析。

1.2.4 miR160f二級結構及靶基因預測 使用The mfold Web Server在線軟件預測普通野生稻miR160f的二級結構，psRNATarget（A Plant Small RNA Target Analysis Server）在線軟件預測普通野生稻miR160f在擬南芥數據庫中的靶基因。普通野生稻miR160f成熟序列被提交到psRNATarget在線軟件并采用默認參數，miRNA與其靶基因錯配數等于或少于3個。

1.2.5 靶基因表達分析 分別設計用于qPCR分析的miRNA靶基因和內標基因Actin的特異性引物。引物設計方法及qPCR方法參照Nuria Hierro等［15］。在ABI 7500 Real Time System 上，使用SYBR?Select Mix進行靶基因的qPCR 反應，檢測相關miRNA靶基因在轉基因擬南芥和野生型擬南芥中的表達情況。

2 結果

2.1 普通野生稻miR160f前體克隆及載體構建

聚合物鉆井液配方1#4%BTJ+0.2%QYHN+0.2%TSN+0.4%MAN104+0.4%MAN101+0.5%FPAY+2%SMP-1+1%SPNH+2%KR-n+BA；

通過PCR從普通野生稻基因組DNA中擴增得到長度為165 bp的普通野生稻miR160f前體，使用mfold軟件預測其二級結構（圖1），普通野生稻miR160f前體形成完美的二級結構。將所測序列與在線軟件預測的普通野生稻miR160f的二級結構序列進行比對，相似性為100%（圖2）。將普通野生稻miR160f前體克隆到pCAMBIA3301上（圖3）。

2.2 miR160f轉基因植株的分子檢測

以轉基因擬南芥DNA為模板，在轉基因植株中擴增出589 bp的bar基因（圖4-A），說明表達載體成功轉入擬南芥植株中。為了檢測轉基因植株中是否有普通野生稻miR160f的表達，以轉基因擬南芥RNA為模板，對成熟miR160f進行擴增，在轉基因植株中擴增出分子量大小為70 bp左右的條帶（圖4-B），說明轉基因植株中有普通野生稻miR160f的表達。

圖1 普通野生稻miR160f前體二級結構

圖3 pmiR160f-bar載體圖譜

圖4 miR160f轉基因植株的分子檢測

2.3 miR160f轉基因植株的表型觀察

使用農桿菌介導的花序浸染法將構建好的pmiR160f-bar植物表達載體轉入擬南芥植株，待植株成熟后收集種子，在選擇培養基中篩選出轉基因幼苗，然后移栽到營養土中，在光照16 h/黑暗8 h、光照強度為180 μmol/ （m2·s）、溫度為22℃、相對濕度為70%的光照培養箱中培養。成熟后收獲種子，野生型和轉基因植株各種植32株，對其首次抽薹時蓮座葉數目、首次抽薹時間以及首次開花時植株高度進行觀測統計，并作3次生物學重復，結果（表1）表明，轉pmiR160f-bar基因擬南芥蓮座葉比野生型平均少2片，抽薹時間平均提前1 d。由于蓮座葉數目與植物開花存在數量上的關系，蓮座葉數少會造成植物營養期縮短花期提前，這表明miR160f可能

與植物開花時間相關。

表1 miR160f轉基因植株的表型分析

2.4 miR160f在擬南芥中的靶基因預測

將miR160f成熟體序列提交至psRNATarget在線軟件系統預測其靶基因，所預測的靶基因大多為生長素響應因子（ARF），如ARF10、ARF16、ARF17（表2）。ARF家族成員主要在植物生長發育中起重要作用［16］，生長素的作用表現在3個層次：（1）植株水平，如植物的向性運動、頂端優勢、側根發生等；（2）細胞水平，如細胞伸長、細胞分裂及細胞分化等；（3）分子水平，如對生長素快速響應的基因的表達。

表2 miR160f在擬南芥中的靶基因預測

2.5 miR160f靶基因表達分析

由于轉基因株系中miR160f超表達，被miR160f負調控的靶基因表達下調。在擬南芥野生型及轉miR160f基因擬南芥中檢測其靶基因表達，結果（圖5）表明ARF17在轉基因株系中表現出明顯的下調，ARF10、ARF16在轉基因株系中出現少許下調。以往的研究表明，ARF16蛋白調控植物根的發育［10，17］，ARF家族受miR160調節，miR160與植物根發育相關。在本項研究中發現了將普通野生稻中的miR160f轉入擬南芥后，出現蓮座葉數減少，抽薹時間縮短的性狀變化，這說明miR160f可能也與植物的開花時間相關。

3 討論

目前已在擬南芥、栽培稻、玉米和大麥等多種植物中發現了miR160基因的家族成員，這些家族成員共有12個，包括miR160a、b、c、d、e、f、g、h、i、m、 n和o，其中miR160f在栽培稻、小立碗蘚、毛果楊、高粱、豇豆和玉米中被發現［18］。miR160成熟體在不同物種中高度保守，這意味著miR160在植物生長發育上發揮重要的功能。

圖5 miR160f靶基因表達分析

本試驗利用過表達的方法將普通野生稻花期相關miRNA的前體基因轉入擬南芥中，使其在擬南芥中高效表達來研究其功能。試驗中將帶有miRNA前體基因的表達載體通過農桿菌LBA4404介導轉入擬南芥基因組中，獲得過表達的轉基因植株，為進一步研究miRNA的功能提供了試驗系統。關于如何選取miRNA前體基因莖環結構的長度，有的研究中選取含莖環1 kb以上的片段進行轉化［19］，也有研究報道稱僅選取莖環臨近處即可［20］，本研究采用后者。在進行引物設計時，為了防止原來的莖環結構在PCR退火時阻礙引物與模板的結合，本研究在設計引物時是從莖環結構兩側外約10 bp處開始，然后通過mfold軟件分析發現，擴增片段能夠較好地維持原來的莖環結構，即不會影響天然miRNA的產生。當獲得過表達miRNA植株后，通過對其預測的靶基因進行qPCR，來檢測相應靶基因的表達量，從而確定該miRNA到底是作用于哪一個靶基因及該靶基因的具體功能。

許多研究報導了miR160調控植物的側根起始和種子發育［21］，本研究首次在普通野生稻中克隆得到miR160f的前體，轉化模式植物擬南芥，結果表明轉miR160f擬南芥植株表現出蓮座葉數目減少、首次抽薹時間縮短等性狀變化，由于蓮座葉數目與植物開花存在數量上的關系，蓮座葉減少會造成植物營養期縮短、花期提前，這說明miR160f還可能

參與植物花期的調控。

同時，我們利用生物信息學的方法預測了miR160f在擬南芥中的靶基因，通過對野生型與轉miR160f擬南芥中的靶基因ARF家族成員ARF10、ARF16和ARF17進行表達分析，發現它們的表達均下調，其中ARF17下調表達最為明顯，而ARF家族成員多與植物根的發育相關，因此證明了miR160f確實參與植物根的發育。

4 結論

本研究克隆了普通野生稻miR160f前體基因并預測出二級結構，在擬南芥中表達miR160f，結果表明與野生型擬南芥相比，轉miR160f擬南芥植株蓮座葉數目減少，抽薹時間縮短，普通野生稻miR160f在擬南芥中存在3個靶基因：ARF10、ARF16和ARF17，通過對靶基因進行qPCR發現，ARF17下調表達最為顯著。表明miR160不僅影響根的發育，還可能與水稻的開花時間相關。

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（責任編輯 李楠）

Clone and Function Analysis MiR160f in Common Wild Rice（Oryza rufipogon Griff.）

Yang Songnan1Wang Jiao2Chen Zongxiang2Tian Xinjie1Zhang Jingwen2Long Yan2Pei Xinwu2Yuan Qianhua1
（1. College of Agriculture，Hainan University，Haikou 570228；2. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

MicroRNAs are a class of non-coding RNAs involved in post- transcriptional control of gene expression. Former study on Arabidopsis thaliana reveals that miR160 involves in root cell division and differentiation by regulating auxin response factors（ARF）thus influence the root development. This study cloned miR160f gene from common wild rice and transferred into Arabidopsis thaliana to identify its function. The results showed that over-expression of miR160f decreased the number of rosette leaves, shortened bloting time, leading to early flowering. RT-PCR showed the expressions of gene ARF10，ARF16 and ARF17 are down-regulation caused by miR160f in transgenic Arabidopsis thaliana, while the deficiency of ARF10 and ARF16 protein can inhibit root cap cell differentiation, lose control of cell division and lead to ectopic expansion of apical stem cell populations Therefore, the result demonstrates that miR160 not only influence on root development, but also may influence flowering time of common wild rice.

MiRNA Flowering time Common wild rice Arabidopsis thaliana Expression vector

2014-04-22

國家轉基因重大專項2014ZX08011-001，公益性行業（農業）科研專項經費項目（201403075），教育部熱帶作物新品種選育工程中心聯合資助項目

楊松楠，男，碩士研究生，研究方向：植物基因工程；E-mail：ysnysn@126.com

裴新梧，研究員，研究方向：植物基因工程；E-mail：peixw@mail.caas.net.cn

袁潛華，研究員，研究方向：作物栽培、農業生物技術；E-mail：qhyuan@163.com