馬鈴薯塊莖形成相關基因STI-LIKE在擬南芥植株發育中的功能驗證

平海濤王玉萍王東霞周曉潔

（1.甘肅省作物遺傳改良與創新重點實驗室 甘肅省干旱生境作物學國家重點實驗室培育基地，蘭州 730070；2.甘肅農業大學生命科學技術學院，蘭州 730070；3. 甘肅農業大學園藝學院，蘭州 730070）

馬鈴薯塊莖形成相關基因STI-LIKE在擬南芥植株發育中的功能驗證

平海濤1，2王玉萍1，3王東霞1周曉潔1，2

（1.甘肅省作物遺傳改良與創新重點實驗室 甘肅省干旱生境作物學國家重點實驗室培育基地，蘭州 730070；2.甘肅農業大學生命科學技術學院，蘭州 730070；3. 甘肅農業大學園藝學院，蘭州 730070）

馬鈴薯塊莖的形成涉及一系列基因的表達和關閉。以馬鈴薯普通栽培品種“大西洋”為試驗材料，采用RT-PCR擴增獲得馬鈴薯STI-LIKE基因全長片段。RT-PCR定量分析表明，該基因在馬鈴薯營養器官中均有表達。生物信息學分析表明STI-LIKE蛋白具有3個TPR結構域，在高等植物中具有高同源性，是一個普遍存在的蛋白質。為驗證STI-LIKE蛋白在擬南芥植株發育中功能，分別構建該基因強啟動子表達載體（pBI121）和干擾載體（pHANNIBAL和pART27），轉化擬南芥獲得了兩種載體的擬南芥轉基因植株，同時制備STI-LIKE蛋白抗體驗證轉基因植株蛋白表達。研究結果表明STI-LIKE基因可能參與擬南芥株型發育過程。

馬鈴薯 STI-LIKE基因 TPR結構域 株型發育

馬鈴薯塊莖既是無性繁殖的“種子”，也是產量構成和營養儲藏器官。塊莖形成和發育是馬鈴薯植株同化產物的利用及地下器官形態建成的復雜過程，不同品種、不同生態環境條件下，塊莖形態、營養成分等各方面均表現出差異，成熟塊莖大小相差可達到100倍［1］。馬鈴薯塊莖發育是在內源生長調節物質和外部環境因素共同影響下相關基因在發育過程中程序性表達的結果，涉及一系列基因的表達與關閉［2-5］。研究表明，HSP17.7、CONSTANS和CDPK1［6-8］對馬鈴薯塊莖的形成起調控作用。

擬南芥STI-LIKE蛋白含有TPR和STI1結構域。TPR結構域是一個由34個氨基酸重復的串聯結構單元，最初是在研究細胞分裂時發現的［9］。TPR結構域包含蛋白參與細胞周期、細胞應激、基因轉錄、蛋白折疊和蛋白運輸等一系列生理生化反應［10-12］。一些TPR結構域包含蛋白可與Hsp90相互作用［13］，起到信號傳導作用。TPR結構域介導蛋白的相互作用和蛋白質復合體的組裝［14］。STI結構域是熱激蛋白結合結構域，存在于蛋白質N末端或C末端，介導蛋白質和HSP蛋白相結合［15］。在高光和熱激狀態下，擬南芥STI蛋白累積量迅速上升［16，17］。STILIKE同源蛋白STI磷酸化蛋白2C與細胞分裂激酶呈負相關［15］。

在我們前期的研究中發現，STI-LIKE蛋白在馬鈴薯塊莖的發育階段中表達量呈上升趨勢，推測其可能在塊莖發育中起關鍵作用［18］。由于TPR結構域和STI結構域的功能及STI-LIKE蛋白在細胞周期調控中的功能，推測STI-LIKE基因可能參與植株發育過程的調控。本研究通過構建STI-LIKE干擾載體和強啟動子表達載體轉化模式植物擬南芥，驗證其在擬南芥生長發育過程的功能，旨在分析STI-LIKE蛋白在植物發育中的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

馬鈴薯普通栽培品種“大西洋”和擬南芥（生態型Columbia）由甘肅省作物遺傳改良與創新重點實驗室提供。

KOD-Plus高 保 真 酶、Target Clone-Plus- A試劑盒購自東洋紡公司，Trizol RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司，反轉錄試劑盒購自Thermo公司，限制性內切酶購自TaKaRa公司，T載體pMD19-T購自寶生物工程有限公司，pET28原核表達載體購自Novagen公司，pHANNIBAL和pART 27為實驗室保存質粒，其他試劑為國產試劑。

1.2 方法

1.2.1 基因的確定 前期在馬鈴薯塊莖發育過程差異蛋白質組研究中發現STI-LIKE蛋白在塊莖發育過程中表達豐度上升，可能參與馬鈴薯塊莖的發育［18］。根據NCBI的EST數據庫確定了馬鈴薯STI-LIKE基因的CDS序列。

1.2.2 RNA提取與cDNA合成 按照Trizol試劑盒的方法提取馬鈴薯塊莖總RNA，以總RNA為模板按照Thermo反轉錄試劑盒的方法反轉錄合成第一鏈cDNA。

1.2.3 引物設計與目的基因的克隆

1.2.3.1 引物 利用軟件DNAMAN設計引物，由上海生工合成。目的片段擴增引物35sF和35sR；以RNAixbaF、RNAibamhR、RNAixhoF和 RNAikpnR為RNAi片段擴增引物；以antibodyF和antibody為擴增引物制備抗原。

35sF：aatctagaATGGCCGAAGAAGCTAAGGCCA AAGG，35sR：ttctcgagTTATCTAACTTGCACAATTCCT GC；

RNAixbaF：aatctagaATGGCCGAAGAAGCTAAG GCCAAAGG，RNAibamhR：aaggatccCTGTTGCAAATA ACCCCTTGTACTCG；

RNAixhoF：aactcgagATGGCCGAAGAAGCTAAG GCCAAAGG，RNAikpnR：aaggtaccCTGTTGCAAATAA CCCCTTGTACTCG；

AntibodyF：aactcgagAAAGATTGTGACACAGCTGTTG，AntibodyR：aaggatccGAGTTCCTGATTCTGAGGATC。

1.2.3.2 STI-LIKE基因目的片段擴增 以反轉錄合成的cDNA為模板，利用PCR反應合成目的片段。反應體系50 μL、模板2 μL，KOD-plus 0.5 μL、引物（35sF，35sR）各1 μL，buffer 5 μL，dNTP 4 μL，水36.5 μL。反應條件：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，55℃復性15 s，68℃延伸2.5 min 35個循環。RNAi載體目的片段，抗體目的片段制備PCR延伸時間為1 min，其余反應體系與目的片段擴增一致。擴增片段以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后測序。

1.2.3.3 STI-LIKE基因生物信息學分析 利用NCBI數據庫和該網站提供的blast工具進行同源蛋白比對分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）。蛋白質結構域由NCBI網站預測給出，蛋白質三級結構的預測利用蛋白專家系統在線工具（http：//www.expasy.org/）完成。

1.2.3.4 STI-LIKE基因過表達載體的構建 切膠回收全長片段，酶切連接到pBI121。質粒轉化大腸桿

菌Top 10，挑取白斑克隆PCR鑒定，酶切驗證。

1.2.3.5 STI-LIKE基因RNAi載體構建 以酶Xba I、BamH I和Xhol I、Kpn I分別雙酶切目的片段。Xba I、BamH I和Xhol I、Kpn I分別先后雙酶切pHANNIBAL載體，挑取白斑克隆PCR 鑒定。將pHANNIBAL與pART27分別用酶Spe I和Not I雙酶切后將pHANNIBAL酶切片段連接到pART27，挑取白斑克隆PCR 鑒定。

1.2.3.6 STI-LIKE基因表達定量分析 分別提取馬鈴薯塊莖、莖、葉、匍匐莖和根的RNA并定量，并使模板濃度一致，進行RT-PCR反應。反應體系，100 ng模板，上下游引物各1 μL，buffer 5 μL，dNTP 4 μL，Taq酶0.5 μL，水36.5 μL。反應條件：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，55℃復性15 s，72℃延伸2.5 min，30個循環。

1.2.3.7 STI-LIKE抗原蛋白表達和純化 對目的蛋白進行同源比對，預測跨膜結構。選取無跨膜域片段區作為抗體制備的抗原區段。以引物（Antibody和AntibodyR）擴增cDNA，XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切目的片段與pET28，連接并轉化大腸桿菌。挑取白斑克隆PCR 鑒定提質粒，轉化大腸桿菌DE3，誘導后蛋白過鎳離子親和交換柱純化制備抗體。

1.2.4 擬南芥的遺傳轉化 擬南芥的遺傳轉化具體方法參照杜培粉［19］進行，以1/2MS+L77培養基重新懸浮利用花藥侵染法侵染花蕾兩次，收獲的擬南芥種子播種于含有50 mg/L卡那霉素的1/2 MS 培養基中，提取12 d 未黃化的幼苗進行檢測。

2 結果

2.1 RNA提取與目的基因克隆

馬鈴薯“大西洋”總RNA提取結果表明RNA（28S、18S、5S）完整無降解。合成總cDNA后稀釋100倍，以引物（35sF，35sR）擴增得到目的片段（圖1）。

圖1 馬鈴薯總RNA提取及目的基因RT-PCR

2.2 生物信息學分析

同源比對的結果表明STI-LIKE只存在于高等植物中，低等植物中沒有同源蛋白（圖2）。同源性分析還表明在高等植物中STI-LIKE保守性很高，并且具有3個TPR結構域，其中一個TPR結構域靠近N末端，其它兩個靠近C末端（圖3）。

圖2 馬鈴薯STI-LIKE蛋白同源性分析

圖3 馬鈴薯STI-LIKE蛋白結構域預測

2.3 STI-LIKE基因過表達載體的構建

將目的片段連到載體后，挑去白斑克隆，酶切檢測目的片段（1 700 bp）并利用載體通用引物測序，確定連入的目的片段無錯配，轉化農桿菌并侵染擬南芥（圖4）。

圖4 pBI121載體酶切檢測

2.4 STI-LIKE基因的RNAi載體的構建

擴增獲得兩條目的片段（圖5-A），分別連接到pHANNIBAL載體。陽性pHANNIBAL載體雙酶切后得到大小相近的兩個片段（圖5-B）。將pHANNIBAL與pART27雙酶切連接后，挑取白斑克隆PCR 鑒定（圖5-C）。測序結果正確無錯配。將質粒轉化到農桿菌侵染擬南芥。

圖5 STI-LIKE基因干擾載體的構建

2.5 STI-LIKE基因在各器官表達定量分析

定量分析表明，STI-LIKE基因在馬鈴薯各組織器官（無花器官）中都有表達，其中在根中表達量最低（圖6）。

圖6 馬鈴薯各營養器官STI-LIKE基因表達量定量分析

2.6 抗原蛋白表達和純化

小量誘導（圖7-A）表明，IPTG誘導3 h后濃度達到峰值。大量誘導（圖7-B）表明，抗原蛋白主要存在于沉淀中。純化后SDS-PAGE（圖7-C）檢測，純化效果理想，用純化后蛋白制備抗體。

圖7 馬鈴薯STI-LIKE蛋白抗原的小量誘導（A）、大量表達（B）和純化檢測（C）

2.7 轉基因擬南芥表型分析及驗證

對生長3周的轉基因植株觀察，結果（圖8）發現過表達STI-LIKE基因植株生長和野生型表型相同，而干擾表達STI-LIKE基因植株明顯小于野生型

植株。Western blot（圖9）檢測表明野生型植株與過表達STI-LIKE基因植株的STI-LIKE蛋白表達量無顯著差異，而干擾表達STI-LIKE基因植株中STILIKE蛋白表達量顯著降低，低于1/2野生型植株表達量。

圖8 轉STI-LIKE基因擬南芥植株表型分析

圖9 轉STI-LIKE基因擬南芥植株免疫印跡分析

3 討論

同源比對的結果表明STI-LIKE蛋白在高等植物中具有高度保守性，同時也說明其可能具有相似的功能［19］。同時STI-LIKE蛋白不具有信號肽并定位于細胞質。3個主要TPR結構域分布在N末端和C末端，表明可能是通過與另外兩個蛋白形成一個三亞基復合體蛋白質的形式實現其功能［14］。對馬鈴薯的根、葉、莖、匍匐莖和塊莖中STI-LIKE表達分析表明該基因并不具有嚴格組織特異性，在馬鈴薯各器官組織中廣泛表達［20］。由此推測該基因對馬鈴薯塊莖發育的影響可能是通過調控共有的代謝通路來影響馬鈴薯塊莖的發育過程。

對轉基因擬南芥植株的表型分析是植物基因功能驗證模式體系，對過表達和干擾表達轉STI-LIKE基因擬南芥植株表型觀察表明，過表達STI-LIKE基因對擬南芥發育無顯著影響，而干擾表達STI-LIKE基因卻能夠使擬南芥植株發育過程受阻，又由于STI-LIKE蛋白在高等植物中具有高度同源性，推測STI-LIKE基因在擬南芥和馬鈴薯中的功能相同［21］，是高等植物生長發育所必須的。本研究為STI-LIKE基因在調節擬南芥植株發育和馬鈴薯塊莖發育的進一步功能驗證奠定了基礎。

4 結論

參與馬鈴薯塊莖形成的STI-LIKE蛋白具有3個TPR結構域，在高等植物中具有高同源性和保守性，表達不存在組織特異性；過表達STI-LIKE基因對擬南芥發育無影響，干擾表達STI-LIKE基因使擬南芥植株發育受阻，表明STI-LIKE基因為植物發育的必需基因。

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（責任編輯 李楠）

Functions of Potato Tuber Formation-related Gene STI-LIKE in Phenotype of Arabidopsis thaliana

Ping Haitao1，2Wang Yuping1，3Wang Dongxia1Zhou Xiaojie1，2
（1. Gansu Key Laboratory of Crop Improvement & Germplasm Enhancement，Gansu Provincial Key Laboratory of Aridland Crop Science，Lanzhou 730070；2. College of Life Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070； 3. College of Horticulture, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070）

A series of gene’s expression and silencing were involved in potato tuber formation. The full length of potato STI-LIKE gene was cloned by using the RT-PCR（reverse transcription PCR）method from the potato variety “Atlantic”. The expression of STI-LIKE gene in all potato organs were analyses by real time PCR analysis. The results showed that STI-LIKE gene expressed in all potato organs. The bioinformatics analysis indicated that STI-LIKE protein contains three TPR domains, and the STI-LIKE gene was homologous recombination in higher plants. The expression vector（pBI121）and interference vectors（pHANNIBAL and pART27）were constructed and transferred to Arabidopsis thaliana. The STI-LIKE protein expression level was examined by Western blot with specific antibody. The results indicated that STI-LIKE gene might be associated with the growth and development of seedling of Arabidopsis.

Potato STI-LIKE gene TPR domain Phenotype

2014-04-08

國家自然科學基金項目（31060063，31260094），甘肅省自然科學基金項目（0803RJZA0510），甘肅省教育廳高校科研專項（1002-07），甘肅省財政廳高校基本科研業務費

平海濤，男，碩士研究生，研究方向：作物遺傳育種；E-mail：pinghaitaopht@163.com

王玉萍，女，副教授，作物遺傳育種；E-mail：wangyp@gsau.edu.cn