馬鈴薯AGPase活力反饋調控光合速率定量分析

白樺崔雪瓊白少星姚新靈

（1.寧夏農業學校，銀川 750021；2.鄭州第二人民醫院，鄭州 450063；3.寧夏大學生命科學學院，銀川 750021）

馬鈴薯AGPase活力反饋調控光合速率定量分析

白樺1崔雪瓊2白少星3姚新靈3

（1.寧夏農業學校，銀川 750021；2.鄭州第二人民醫院，鄭州 450063；3.寧夏大學生命科學學院，銀川 750021）

為了揭示ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）改變對葉片光合作用的反饋調控，以改變AGPase活力的馬鈴薯轉化株系為材料，測定了其AGPase活力（AA）、塊莖淀粉積累量（SC）、葉片光合速率（PR）、葉綠素（CC）和蔗糖含量（SUC）等；測定結果分析顯示，各株系的AGPase活力（AA）、塊莖淀粉積累量（SC）和葉片光合速率（PR）間存在顯著差異，且均顯著高于對照；株系間AGPase活力、塊莖淀粉含量和葉片光合速率呈顯著正相關性；每單位AGPase活力上升可貢獻貯藏器官淀粉積累增加2.5%，且是影響葉片光合速率的重要因素；結果表明，AGPase不僅是下游淀粉積累的限速酶，而且可向上游反饋調控光合速率。

淀粉含量 光合速率 ADP-葡萄糖焦磷酸化酶 相關性

盡管合成途徑中的代謝物通過異構和氧化還原等途徑調控淀粉積累，但就從碳固定到淀粉積累過程中對淀粉生物合成調控的理解則十分有限［1］。轉錄組表達譜分析表明，營養缺乏條件下，淀粉生物合成相關基因上調表達，而淀粉消耗及光合作用途徑基因則下調表達［2］。

營養脅迫使植物更傾向于光合產物用于淀粉積累，在聯系光合產物與淀粉積累間的代謝途徑中，晝夜周期通過Rubisco介導的CO2的固定調控光合作用，還調控著葉片轉運淀粉的降解速度，確保夜間生長對碳的需求［3］。在途徑下游，腺苷二磷酸葡萄糖焦化酶（AGPase）也受到晝夜周期調控［4］。

AGPase以磷酸葡萄糖為底物，代謝合成腺苷二磷酸葡萄糖（ADP-葡萄糖），后者是淀粉生物合成的底物；在細菌和植物中AGPase分別是糖原和淀粉生物合成的限速酶，植物AGPase是由大亞基和小亞基組成的異源四聚體；葉片中AGPase不同isoform受到長短日照的光周期調控，呈現分化表達［5］。

大腸桿菌不同菌株中glgC的突變，可顯著改變其編碼AGPase的活力，表達glgC的馬鈴薯，其塊莖淀粉含量提高30%以上［6］；植物中過量表達具有催化代謝功能的AGPase小亞基編碼基因，可顯著提高AGPase活力，增加貯藏器官及其它組織的淀粉積累［7-9］。

在光合與淀粉積累間的代謝途徑中，AGPase通過其活力改變，調控其下游淀粉的積累；AGPase催化的底物磷酸葡萄糖來自光合作用，盡管已明確AGPase小亞基cysteine 81是介導晝夜周期調控、形成二聚體所必需的［10］，但AGPase對途徑上游、尤其是如何影響光合作用尚屬未知。

1 材料與方法

1.1 材料

前期研究完成了由大腸桿菌glgC、馬鈴薯淀粉粒結合淀粉合成酶基因和AGPase小亞基基因組成的重組基因構建及轉化，獲得表達了不同目的基因的8個株系，2株SG株系（株系SG1、SG2）表達了單拷貝大腸桿菌glgC（編碼AGPase），2株AG株系（株系AG1、AG2）表達單拷貝glgC和馬鈴薯AGPase小亞基基因（SS）反義cDNA，4株GG（株系GG1-4）表達單拷貝glgC和馬鈴薯淀粉粒結合淀粉合成酶基因（GBSSI）反義cDNA株系；本研究以此8個株系和其宿主紫花白對照為材料進行其后的測定及分析。

實驗室條件下繁殖各株系試管苗，待試管苗生長至8 cm，移栽于盛有品氏托普基質的營養缽內，每2 d澆水1次，在溫度25℃，光照強度12 kLx、15 h光照下培養到15 d后，移至同樣光照強度8 h光照下培養誘導結薯，誘導培養15 d后，隨即分別在各株系個體上、中、下3個部分采集生長良好、大小一致的葉片1 g，用于葉綠素含量、蔗糖含量和ADP-葡萄糖焦磷酸化酶活力測定，樣品隨采隨用。第30天收獲塊莖，風干3 d后儲藏于4℃用于塊莖淀粉含量測定。

1.2 方法

光照誘導培養15 d后，采用英國產CIRAS-Ⅰ型便攜式光合測量儀測定凈光合速率（以下簡稱光合速率），測定操作步驟按照說明書進行；上午10時，在每個個體上、中、下3個部位，選擇大小相似、充分伸展的8個葉片，取均值為單次測定結果，間隔1 d測定第2次，同前測定計算的數據為第2次重復，測定共重復3次。

按照Wickliff等［11］的方法進行葉綠素含量（w/w，%），蔗糖含量（w/w，‰）用蔗糖含量測定試 劑 盒（Glucose and Sucrose Assay Kit、ab65334，ab-cam，USA）進行。采用淀粉測定試劑盒（EnzyChromTMStarch Assay Kit BioAssay Systems，USA）完成塊莖淀粉含量測定。塊莖ADP-葡萄糖焦磷酸化酶活力測定按照姚新靈等［12］的方法進行。

為了便于直觀比較分析，SG、AG和GG株系3個群體各個體葉綠素含量、光合速率和蔗糖含量除以群體中的最大均值后，以得到的商為統計變量進行統計分析；群體各個體塊莖淀粉含量減去對照株系塊莖淀粉含量所得所得差作為塊莖淀粉含量統計變量進行統計分析。

2 結果

2.1 AGPase活力、塊莖淀粉含量和光合速率差異顯著

面對迅猛的城市化浪潮，新一輪針對城市發展的研究和實踐將迎來熱潮。古希臘哲學家赫拉克利特曾經說過：“看不見的和諧比看得見的和諧更美。”以文化營銷的方式，為城市的發展注入新的可持續發展動力。通過充分挖掘城市文化資源、有效將文化資源轉變為文化資產、增強城市文化認同、提升城市治理能力等途徑，以打造城市多元文化景觀空間、尋求城市準確清晰定位、運用“文化+”、進行多產業融合、巧用新媒介平臺拓寬城市宣傳渠道等方式，不僅可以完善城市文化營銷的理論，也能更好地推動城市的良性發展，具有較強的實用性和前瞻性。

8個轉化株系AGPase活力、塊莖淀粉含量、葉片葉綠素、葉片蔗糖含量和葉片光合速率測定結果分析顯示，8個株系塊莖淀粉含量、AGPase活力、葉片光合速率間及塊莖淀粉含量間存在顯著差異（P ＜0.05），且極顯著高于對照株系（P＜0.01）（圖1-圖3）；葉片葉綠素和蔗糖含量在各株系間存在不顯著差異（P ＜0.05）（圖4）。

2.2 AGPase活力、塊莖淀粉含量和光合速率的相關性

2.2.1 AGPase活力與塊莖淀粉含量呈正相關性 轉化株系塊莖AGPase活力間、塊莖淀粉含量間及葉片光合速率間差異顯著，且顯著高于對照。為了明確三者聯系，相關分析顯示，盡管AGPase活力與葉片光合速率無顯著相關性，但光合速率與塊莖淀

粉含量間相關系數為0.651，呈顯著Pearson相關性（P ＜0.05）。

圖1 株系塊莖淀粉含量比較

圖2 株系AGPase活力比較

圖3 株系葉片光合速率比較

轉化株系間塊莖淀粉含量和AGPase活力相關分析顯示，兩指標相關系數為0.875，呈顯著Pearson相關性（P＜0.01）；塊莖淀粉含量和AGPase活力回歸模型方差分析顯示，回歸模型顯著（P＜0.01），回歸系數為2.47；t檢驗顯示其統計顯著（P＜0.01），常數為5.45；所以塊莖淀粉含量（SC）和AGPase活力（AA）一元線性方程為：SC = 2.47AA + 5.45（圖5）。

圖4 株系葉綠素及葉片蔗糖含量比較

圖5 塊莖淀粉含量（SC）和AGPase活力（AA）線性方程

2.2.2 塊莖淀粉含量與光合速率呈正相關性 光合速率與塊莖淀粉含量回歸模型方差分析顯示，回歸模型顯著（P＜0.05），回歸系數為0.22；t檢驗顯示其統計顯著（P＜0.05），常數為0.55；所以光合速率（PR）與塊莖淀粉含量（SC）一元線性方程為：PR=0.22 SC+0.55（圖6）。

2.2.3 AGPase活力與與光合速率呈正相關性 AGPase活力與光合速率回歸模型方差分析顯示，回歸模型顯著（P＜0.05），回歸系數為0.42；t檢驗顯示其統計顯著（P＜0.05），常數為2.382；所以，光合速率（PR）與塊莖淀粉含量（SC）一元線性方程為：PR = 0.42AA + 2.38（圖7）。

2.3 AGPase活力、塊莖淀粉含量和光合速率相關性比較

以各回歸顯著的3個指標AGPase活力、光合

速率、塊莖淀粉含量的回歸系數的倒數表示其各自的相關程度的直觀結果如圖8所示，其中數字越小表示兩者越接近，相關程度越高；AGPase與光合作用的相關程度遠不及其與淀粉積累，但光合作用與AGPase的相關程度遠高于光合作用與淀粉積累的相關程度。

圖6 光合速率（PR）與塊莖淀粉含量（SC）線性方程

圖7 AGPase活力（AA）與光合速率（PR）線性方程

圖8 回歸系數倒數表示的相關程度結果的直觀示意圖

3 討論

各株系AGPase活力、塊莖淀粉含量、葉片光合速率間及塊莖淀粉含量間存在顯著差異，且極顯著高于對照株系，這一結果表明，大腸桿菌glgC重組基因體內表達，提高了AGPase活力，增加了轉化株系塊莖淀粉積累，這與以往研究報道的結果一致［7］，AGPase活力提高增加了ADP葡萄糖的合成，高水平淀粉合成底物—ADP葡萄糖增強了淀粉積累。

塊莖淀粉含量（SC）和AGPase活力（AA）一元線性方程（SC = 2.47AA + 5.45）的結果表明，AGPase活力每增加1單位，可使塊莖淀粉含量提高2.5%；盡管以往就植物淀粉積累依賴于AGPase活力的定性報道諸多［7］，但尚未見塊莖淀粉含量在多大程度上依賴于AGPase活力的定量報道，本研究所得出比率屬首次提出。

光合速率受到內外多種因素影響，本研究光合速率與塊莖淀粉含量顯著正相關的結果表明，貯藏器官淀粉積累的增加可反饋調控光合速率提高，在本試驗條件下，回歸系數為0.22的結果意味著影響光合速率提高的2%來自貯藏器官淀粉積累的增加。

AGPase與光合作用的相關程度遠不及其與淀粉積累，而光合作用與AGPase的相關程度遠高于光合作用與淀粉積累的相關程度，這一結果表明AGPase活力的改變不僅直接調控其下游淀粉的積累，而且向上游通過反饋調控光合作用間接調控淀粉積累，近年研究證據也支撐了AGPase反饋調控光合作用。

光合電子傳遞鏈產生的氧化還原信號，參與卡爾文循環、ATP合成及NADPH從葉綠體輸出［13］，抑制電子傳遞鏈中硫氧還蛋白（Trx f1）表達，導致光激活的還原態AGPase活力衰減，淀粉合成隨之下降［14］，AGPase與磷酸丙糖相關功能缺失的雙突變體（adg1-1/tpt-2），在高光強下碳水化合物合成減少［15］；因此，AGPase通過光合電子傳遞反向影響光合作用。

葉綠素含量和蔗糖含量并未隨貯藏器官淀粉積累的增加而改變，同時也未受光合速率的影響，這一結果表明，光合速率提高并未改變葉片葉綠素含量和蔗糖含量相關的代謝平衡。結果同時也表明，AGPase活力改變并未通過葉綠素含量和蔗糖含量反饋調控光合作用，而是通過其它目前尚不明確的途徑調控光合作用，這有待進一步研究。

4 結論

（1）AGPase不僅是下游淀粉積累的限速酶，而且可向上游反饋調控光合速率。（2）AGPase對光合作用的反饋調控關鍵節點有待進一步研究。

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（責任編輯 李楠）

Quantitative Analysis on Feedback of AGPase to Photosynetic Rate in Potato

Bai Hua1Cui Xueqiong2Bai Shaoxing3Yao Xinling3
（1. Ningxia Agriculture School，Yinchuan 750021；2. Zhengzhou 2ndRenmin Hospital，Zhengzhou 450063；3. Life Science School，Ningxia University，Yinchuan 750021）

To reveal feedback regulation of ADP-pyrophosphrolase（AGPase）to photosynthesis, AGPase activities（AA）, starch contents（SC）in tuber, photosynthetic rates（PR）, chlorophyll contents（CC）and sucrose contents（SUC）in leafs were assayed with potato transgenic lines showing difference on ADP-pyrophosphrolase activities. The data analysis showed that AA, SC and PR in transgenic lines were significantly higher than control line. Significantly differences were found between AA, SC and PR among the lines. Correlation analysis showed that there were positive correlations between AA, SC and PR. Per unit rising of AGPase activities can contributed 2.5% increase of starch contents in sink tissue. AGPase was a factor playing a role in regulation of photosynthetic rates. The result indicated that AGPase not only regulates starch accomulation on the downstream, also feedback to modulate photosynthetic rate.

Starch contents Photosynthetic rate ADP-pyrophosphrolase Correlation

2014-04-09

國家自然科學基金項目（30660079），2012年寧夏科技支撐計劃

白樺，女，副教授，研究方向：植物生理學；E-mail：1486814368@qq.com

姚新靈，博士，教授，研究方向：植物分子生物學；E-mail：chinanoahl@163.com