綠頭鴨IFN-α的可溶性表達及其活性分析

劉瀾瀾莊艷娜于曉紅曾祥偉

（1.黑龍江中醫藥大學基礎醫學院，哈爾濱 150040；2.東北林業大學野生動物資源學院，哈爾濱 150040）

綠頭鴨IFN-α的可溶性表達及其活性分析

劉瀾瀾1莊艷娜2于曉紅1曾祥偉2

（1.黑龍江中醫藥大學基礎醫學院，哈爾濱 150040；2.東北林業大學野生動物資源學院，哈爾濱 150040）

為了利用原核表達系統研制有生物活性的鴨IFN-α。以pMD18T-MaIFN-α為模板擴增綠頭鴨IFN-α成熟肽基因，將其克隆至原核表達載體pET-32a中，在大腸桿菌BL21中進行變溫誘導表達。SDS-PAGE分析表達結果，并用Western blotting進行驗證。Ni2+樹脂柱純化目的蛋白后，測定其生物活性。結果表明，重組pET-32a（+）-MaIFN-α在大腸桿菌BL21成功表達，主要以可溶性形式存在，Western blotting分析顯示目的蛋白具有良好的抗原性。細胞病變抑制法測定重組鴨IFN-α的抗病毒活性約為8×104U/mL；熒光定量PCR方法檢測顯示表達的重組鴨IFN-α使NDV在DEF上的復制受到了明顯的抑制，48 h時間點相對抑制率高達91%。這些都表明表達的重組鴨IFN-α具有良好抗病毒活性。

綠頭鴨 IFN-α 可溶性表達 活性分析

干擾素（Interferon，IFN）是具有良好的抗病毒、抗腫瘤活性和免疫調節作用的細胞因子［1-3］。目前IFN可分為Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型IFN 主要包括IFN-α、β、ω、δ、κ、ε、ξ 和τ 等，Ⅱ型IFN 只有IFN-r一種［4］。其中α-干擾素以其突出的抗病毒效應而備受重視，其抗病毒、抗腫瘤活性作用要明顯強于Ⅱ型IFN；同時也具有一定的免疫調節作用，但要弱于Ⅱ型IFN。

鴨IFN-α的開放閱讀框架由576個核苷酸組成，編碼191個氨基酸，前30個氨基酸為信號肽，后161個氨基酸為成熟活性蛋白。1995年Schultz等［5］首次成功克隆了鴨I型干擾素基因。國內從2000年開始陸續有關于鴨干擾素的報道，目前北京鴨、番鴨、紹興鴨和四川麻鴨等的序列先后被克隆和測定［6-9］。國內學者也先后利用不同表達系統表達了鴨IFN-α，原核表達重組鴨IFN-α蛋白表達量較高，

但多以包涵體形式存在，需要經過復性才能獲得其生物活性［8］；真核表達系統表達重組鴨IFN-α蛋白具有較好的生物活性，但表達量很低。這些都限制了鴨IFN-α在臨床實踐中的大量應用。獲得高表達量并具有活性的鴨IFN-α是目前亟待解決的問題。

本研究嘗試對綠頭鴨的IFN-α成熟肽基因進行表達，仍然應用原核表達系統，但是通過變溫誘導來優化表達條件，力求減少包涵體的形成，增加融合蛋白的可溶性，旨在獲得具有較高生物活性的鴨IFN-α重組蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體菌株、毒株和試驗動物 含有綠頭鴨IFN-α基因的重組質粒pMD18T-MaIFN-α、pMD18TDNV-F由本實驗室構建并保存，原核表達載體pET 32a（+）、感受態E.coli BL21受體菌購于美國Invitrogen 公司。新城疫病毒（NDV）F48E9株、水泡口炎病毒（vsv）、鴨胚由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所提供。

1.1.2 試劑 DNA凝膠回收試劑盒、限制性內切酶EcoR I、Hind III、Ex Taq酶、T4 DNA連接酶、 One Step SYBR? PrimeScriptTMRT-PCR Kit II、蛋白Marker等購自大連寶生物公司?？笻is標簽單抗、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠IgG 購自Sigma公司。

1.1.3 引物 參考GenBank上發表的鴨IFN-α基因（登錄號：X84764）和NDV的F基因（登錄號：AY508514）相關基因序列，設計了2對引物。其中IFNA-F、IFNA-R用于擴增鴨IFN-α成熟肽基因上游引物分別加入了EcoRⅠ、Hind III酶切位點（酶切位點用下劃線標注）；Ffp、Frp用于擴增新城疫病毒（NDV）的F基因。引物由上海英駿公司合成，具體見表1。

表1 本研究中所使用的引物

1.2 方法

1.2.1 原核表達重組質粒的構建及目的基因的表達 以pMD18T-MaIFN-α為模板，以IFNA-F、IFNA-R為引物，使用Ex Taq酶對鴨IFN-α成熟肽基因進行常規擴增反應，將擴增產物和原核表達載體pET-32a（+）分別用EcoRⅠ和Hind III雙酶切，回收、連接，構建重組表達質粒pET-32a（+）-Ma-IFN-α，并且測序鑒定重組質粒的正確性。將鑒定后的陽性重組質粒轉化入E.coli BL21感受態細胞中，進行變溫誘導表達，在新鮮的含有Amp+的LB培養基中37℃震蕩培養，當菌液OD600nm達到0.6時，加入IPTG，使其在菌液中的終濃度為0.5 mmol/L，25℃誘導表達6 h。然后進行SDS-PAGE分析。

1.2.2 表達產物的Western blotting鑒定 將SDSPAGE凝膠電泳的蛋白帶通過半干法轉移至硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉配制的封閉液中，4℃封閉過夜，以封閉無關蛋白結合位點。一抗使用抗His標簽鼠單克隆抗體、二抗為HRP-羊抗鼠IgG，進行Western blotting檢測，使用DAB顯色試劑盒顯色。

1.2.3 重組蛋白的可溶性分析與純化 收集10 mL誘導后的菌液沉淀，經PBS洗滌后重懸于10 mL PBS（pH8.0）中，加入溶菌酶至終濃度為1 mg/mL，冰浴30 min。冰浴后進行超聲細胞破碎（350 W，工作2 s，間隙3 s，作用10 min），之后4℃10 000 r/min離心20 min，分別收集上清和沉淀，沉淀用等體積量的PBS溶解，SDS-PAGE電泳分析。按照His.Bind純化試劑盒說明書，利用Ni2+樹脂柱對原核表達的鴨IFN-α進行純化。并利用紫外分光光度計對純化的蛋白進行濃度的測定。

1.2.4 細胞病變抑制法測定IFN-α重組蛋白抗病毒活性 制備鴨胚成纖維細胞（DEF），待長成單層后每孔加入5×102、1×103、2×103、4×103、8×103、

1.6×104、3.2×104和6.4×104倍稀釋的純化后的鴨IFN-α 0.1 mL，每個稀釋度設6孔平行樣，37℃作用過夜，每孔加入100TCID50的劑量的水泡口炎病毒（vsv）感染細胞。同時設立病毒組、干擾素+病毒組、空白對照組，24-48 h內觀察結果，在陽性對照孔出現75%以上病變時，判斷結果。以能抑制50%細胞病變的樣品的干擾素稀釋度定義為一個單位干擾素。

1.2.5 熒光定量PCR方法檢測 IFN-α重組蛋白抗病毒活性 試驗分為3組：第1組正常生長細胞組；第2組NDV接種組（細胞接種NDV病毒）；第3組保護組（加重組蛋白后再接種病毒）。將單層DEF細胞中的培養液去掉，第1、2組接入等量維持液，第3組加入10倍稀釋的重組蛋白2 mL。過夜培養后，第2、3組接種100TCID50的NDV。在接毒的6 h、12 h、24 h和48 h，以Ffp、Frp檢測引物，應用熒光定量RT-PCR方法檢測DEF中NDV的含量；同時按照Reed-Muench兩氏法測算病毒的滴度。反應完成后根據其Ct值，按標準曲線換算病毒核酸拷貝數來反映IFN-α重組蛋白抗NDV病毒的效果，用SPSS15軟件進行數據分析，并計算相對抑制率：

相對抑制率（%）=（接種組病毒含量-保護組病毒含量）/接種組病毒含量×100%。

2 結果

2.1 重組質粒pET-32a-MaIFN-α的鑒定

重組質粒pET-32a-MaIFN-α經測序，結果顯示插入的MaIFN-α基因大小、序列和開放閱讀框架均正確無誤，表明成功構建了pET 32a-MaIFN-α原核表達重組質粒。

2.2 重組鴨IFN-α融合蛋白的表達

pET-32a-MaIFN-α重組質粒轉化E.coli BL21感受態細胞中經IPTG誘導表達后，SDS-PAGE分析（圖1）顯示出現了一條特異的蛋白質增強條帶，大小約為39 kD，與預期結果一致，而空載體對照中并無此條帶，由此說明重組鴨IFN-α融合蛋白成功表達。

圖1 表達重組蛋白的SDS-PAGE分析

2.3 表達產物的Western blotting鑒定

對pET-32a-MaIFN-α融合蛋白進行Western blotting分析，結果（圖2）發現在分子量約為39 kD處出現一條特異條帶，表明融合蛋白能與His標簽鼠單克隆抗體發生特異免疫反應，具有良好的抗原性。

圖2 表達重組蛋白的Western blotting分析

2.4 重組蛋白的可溶性分析和純化

SDS-PAGE電泳分析顯示破碎受體菌的上清和沉淀中均有目的蛋白表達，但沉淀中目的蛋白很少，而上清中的目的蛋白含量很多，經蛋白掃描系統分析，目的蛋白越占總蛋白的70%，可見該重組蛋白以可溶性表達為主。

表達的重組蛋白純化后，經SDS-PAGE分析，結果（圖3）顯示在大小約為39 kD處可見一條清晰的蛋白帶，經測定蛋白濃度約為0.98 mg/mL。

2.5 細胞病變抑制法測定IFN-α重組蛋白抗病毒活性

在重組鴨IFN-α樣品進行500-4 000倍稀釋的細胞孔中均未見細胞病變，而稀釋倍數為8 000的細胞孔中有一半細胞孔出現了細胞病變，因此其抗病毒活性（U/mL）=1 U×抑制50%細胞病變的樣品的干擾素稀釋倍數/加入干擾素的體積（mL）= 1 U×8 000/0.1 mL=8×104U/mL。這表明表達的重組鴨IFN-α具有較好的抗病毒活性。

圖3 表達重組蛋白的純化

2.6 熒光定量PCR方法檢測 IFN-α重組蛋白抗病毒活性

應用熒光定量PCR方法檢測了各組不同時間點NDV的含量。結果（圖4）顯示，在接種NDV的12 h內，添加重組鴨IFN-α的保護組的病毒拷貝數和病毒接種組之間相比基本保持一致，兩組的差異并不顯著（P＞0.05）。在24 h出現變化，兩組的病毒拷貝數都有增加，但保護組的病毒拷貝數的增加數量明顯低于病毒接種組，兩組差異顯著（P＜0.05）；在48 h兩組的病毒拷貝數仍在增加，特別是病毒接種組的病毒拷貝數的數量級達107，相比而言保護組的病毒拷貝數增加不多，兩組數據差異顯著（P＜0.05），在該時間點相對抑制率為91.0%而正常細胞組在各個時間點取樣未檢測到病毒核酸。

圖4 NDV拷貝數動態變化的分析

病毒的滴度也呈現了相似的變化趨勢，12 h以內兩組病毒的滴度差異不大（P＞0.05），24-48 h兩組病毒的滴度差異比較明顯（P＜0.05），具體見表2。在48 h，病毒接種組細胞出現部分圓縮、壞死和脫落等細胞病變，而保護組的細胞基本維持正常形態，未見明顯的細胞病變。這都表明表達的重組鴨IFN-α具有良好的抗病毒活性。

表2 NDV病毒滴度（TCID50）動態變化的分析

3 討論

原核系統表達的干擾素的表達量較高，但多以包涵體形式存在，需要經過復性才能獲得其生物活性。包涵體的復性是個費時、費力的過程，而且復性后的蛋白其生物活性通常不高。因此，選擇合適的原核表達載體、優化表達條件來提高IFN-α的可溶性表達尤為重要。本研究中選擇了pET-32a（+）這一高效表達載體，它能快速、高效和穩定地表達基因產物，成本低廉，適合應用于工業化批量生產。該載體表達的目的片段前融合有硫氧還蛋白，它有助于蛋白的折疊，提高可溶性蛋白的含量［10］。此外，研究中使用變溫誘導表達的方法，即在加入IPTG后使用相對較低的溫度（25℃）進行誘導表達，降低了表達產物形成包涵體的幾率，結果表明目前蛋白絕大部分在處理細胞的上清中以可溶形式表達。這些都為重組鴨IFN-α的發酵生產奠定了良好基礎。

在干擾素生物活性的檢測方法中最經典的就是應用vsv/wish細胞系統通過細胞病變抑制試驗方法來測定干擾素的抗病毒活性［11］。該方法需要滴定每個孔病毒的滴度，十分費時費力。此外，干擾素與其受體細胞間的結合具有種屬特異性［12］，因此評價不同的干擾素要選擇不同的指示細胞，這也影響了評價系統的準確性。為了更好地測定表達的重組鴨IFN-α的生物活性，本研究在初步應用經典試驗方法的基礎上，應用熒光定量PCR的方法檢測了IFN-α重組蛋白體外抗病毒的效果，不僅直觀地反映干擾素對病毒復制的抑制效果，同時還能實時對病毒復制的抑制過程進行觀察。

細胞病變抑制試驗方法來測定重組鴨IFN-α的抗病毒活性約為8×104U/mL，明顯高于一些研究中經過包涵體復性的重組鴨IFN-α［8，13］。熒光定量PCR方法檢測重組鴨IFN-α的抗病毒活，從24-48 h

這段時間里，保護組由于表達的重組鴨IFN-α的作用，NDV在DEF上的復制受到了明顯的抑制，相對抑制率高達91%，各組病毒滴度的動態變化結果也進一步驗證了重組鴨IFN-α能有效抑制NDV的復制和增殖。這些都表明，本研究中所表達的重組鴨IFN-α具有良好的抗病毒活性，為今后的大規模的臨床應用奠定了基礎。

4 結論

本研究利用pET-32a原核表達系統，采用變溫誘導的方法成功表達了可溶性的重組鴨IFN-α，經細胞病變抑制法和熒光定量PCR的方法檢測，表達的重組鴨IFN-α具有良好抗病毒活性。

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（責任編輯 李楠）

Soluble Expression and Activity Analysis of Mallard IFN-α

Liu Lanlan1Zhuang Yanna2Yu Xiaohong1Zeng Xiangwei2
（1. College of Basic Medical Science，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040；2. College of Wildlife Resources，Northeast Forestry University，Harbin 150040）

In order to acquire efficient expression and production of biologically active duck IFN-α, the mature protein gene of duck IFN-α was amplified from pMD18T-MaIFN-α. The fragment was linked to the prokaryotic expression vector pET-32a to construct the recombinant expression plasmids pET-32a（+）-MaIFN-α, and then converted into E.coli BL21 cells. The fusion protein was induced to express in the change temperature condition. SDS-PAGE and western blotting analysis were used to examine the fusion protein. After purified by Ni2+resin column, the activity of the expression product was determined. The results showed that the recombinant pET-32a（+）-MaIFN-α expressed a soluble protein after being induced by IPTG. Western blotting analysis showed the fusion protein had expected antigenicity. The activity of the expressed duck IFN-α detected by inhibiting cytopathic effect was about 8×104U/mL. The activity detected by the Real-time PCR showed that the expressed duck IFN-α had a strong inhibition of NDV replication in DEF. This indicated that the expressed duck IFN-α was verified to be of high antiviral activity.

Mallard IFN-α Soluble expression Activity analysis

2014-05-19

黑龍江省自然科學基金項目（C201223），黑龍江中醫藥大學?？蒲谢痦椖浚˙S201402）

劉瀾瀾，女，博士，講師，研究方向：微生物與免疫；E-mail：lanlan0112@126.com

曾祥偉，男，博士，副教授，研究方向：病毒與免疫；E-mail：xiangwei_zeng@163.com