紅羅非魚MyoD基因克隆及序列分析

郭奕惠 范嗣剛 黃桂菊 朱克誠 喻達輝

（中國水產科學研究院南海水產研究所 農業部南海漁業資源開發利用重點實驗室， 廣州 510300）

紅羅非魚MyoD基因克隆及序列分析

郭奕惠 范嗣剛 黃桂菊 朱克誠 喻達輝

（中國水產科學研究院南海水產研究所 農業部南海漁業資源開發利用重點實驗室， 廣州 510300）

MyoD基因是MRFs家族中的一員，能調控肌肉細胞活性和增殖，在肌肉形成過程中起正調控作用。采用同源基因克隆和RACE方法獲得紅羅非魚MyoD基因的cDNA序列。開放閱讀框長903 bp，編碼300個氨基酸，其中第1-114個氨基酸為堿性結構（Basic domain），第109-165個氨基酸為螺旋-環-螺旋結構（Helix-Loop-Helix domain），第199-213個氨基酸為周期蛋白依賴性蛋白激酶4（CDK4）結合區域，第233-249為Helix III結構，無信號肽序列。MyoD蛋白的二級結構為螺旋-環-螺旋二聚體。基于MyoD構建的魚類系統進化樹顯示紅羅非魚，尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚聚為一支。

MyoD 序列分析 克隆 羅非魚

紅羅非魚（Oreochromis sp.）體呈粉紅色，是莫桑比克羅非魚（O. mossambicus）×尼羅羅非魚（O. niloticus）雜交產生的后代。紅羅非魚生長速度快，產量高、肉味鮮美，經濟效益好，在兩廣地區可常年養殖，深受養殖戶和消費者喜愛。

大多數魚類可食性部分主要是肌肉。提高肌肉生長速度能短時間內增加魚的產量，從而增加收益。在分子水平上，魚類肌肉生長受生肌調節因子MRFs家族（Myogenic regulatory factors，MRFs）調控。MRFs家族基因均具有保守的堿性螺旋-環-螺旋結構域（Basic helix-loop-helix，bHLH），該結構域能與E12和E47等蛋白結合形成二聚體復合物，進而與E-box（CANNTG）結合，從而激活肌肉特異性轉錄本［1-3］。

MyoD基因（Myogenic differentiation antigen），是MRFs家族中的一員，能調控肌肉細胞活性和增殖，在肌肉形成過程中起正調控作用，缺失后導致成肌細胞無法進行增殖和分化。相反，MyoD基因

的過度表達會抑制成肌細胞的增殖過程，并促進成肌細胞分化形成成熟的肌纖維細胞［4，5］。1987年首次獲得人的cDNA序列［6］。目前在鯉魚（Cyprinus carpio）［7］、金頭鯛（Sparus aurata）［8］、大口黑鱸（Micropterus salmoide）［9］、 草 魚（Ctenopharyngodon idellus）［10］、奧利亞羅非魚（Oreochromis aureaus）［11］、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）［12］、鱈（Gadus macrocephalus）［13］等魚類中已相繼成功克隆，但尚未有紅羅非魚MyoD基因的研究報道。本研究擬對紅羅非魚MyoD基因進行克隆和序列分析，以期為該基因在水產動物中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用紅羅非魚購買于廣州黃沙水產市場。所用試劑如下：Sample protector，Total RNA Isolation kit、Reverse Transcriptase M-MLV，pMD18-T和DNA Purification kit為大連寶生物工程公司（TaKaRa）產品；大腸桿菌DH5α為Tiangen公司產品，用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）試劑盒進行3'末端和5'末端的擴增。

試驗所用引物如表1所示，均在上海生工生物工程有限公司合成。F1和R1、F2和R2是根據GenBank已登錄的奧利亞羅非魚MyoD（GenBank登錄號：AF270790）設計的特異引物，其中F1和R1用于擴增MyoD部分片段；F1和F2用于MyoD 3'RACE；R1和R2用于MyoD 5'RACE。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 取紅羅非魚新鮮肌肉0.15 g，保存在Sample protector（TaKaRa）中，用RNA提取試劑盒（TaKaRa）提取總RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。

1.2.2 MyoD cDNA克隆 參照Reverse Transcriptase M-MLV逆轉錄酶（TaKaRa）說明書獲得紅羅非魚cDNA第一鏈，其中RNA 200 ng，3'Oligo-dT（10 μmol/L）2 μL，RNase-free H2O補齊至6 μL。使用引物F1和R1擴增MyoD cDNA部分片段；反應程序：94℃預變性3 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 40 s；35個循環；最后72℃ 7 min，PCR產物放于4℃保存。用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，用DNA Purification kit進行膠回收，以pMD18-T作為載體，轉化到大腸桿菌DH5α，經PCR鑒定為陽性克隆的菌液送上海生工生物工程技術有限公司進行測序。

測序得到MyoD cDNA保守序列，設計3'RACE引物（F2）和5'RACE基因特異引物（R2）（表1）。利用Clontech公司的SMARTer RACE cDNA Amplification Kit試劑盒進行3'末端和5'末端的擴增，擴增產物經回收純化并克隆后進行測序。

表1 紅羅非魚MyoD基因克隆所用引物

1.2.3 序列分析 將擴增得到的序列用DNAstar軟件拼接，用NCBI ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm. nih.gov/gorf/gorf.html）找出基因的編碼區，用軟件SignalP3.0軟件分析信號肽［14］，MyoD蛋白序列分析用ProtParam 軟件（http：//au.expasy.org/tools/protpar am.html）預測蛋白理化性質。用SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）分析蛋白三級結構［15］。用MEGA 4.0軟件進行基因進化分析，并用Neighbor-Joining法構建進化樹［16］。

2 結果

通過同源PCR和RACE技術成功克隆了紅羅非魚MyoD基因，GenBank登錄號為FJ907953。用軟件拼接和分析后，MyoD cDNA開放閱讀框長903 bp，編碼300個氨基酸，其中Ser最多，有47個，占15.7%；其次為Leu（26個，8.7%），Asp（24個，8.0%）和Pro（23個，7.7%）。MyoD基因編碼蛋白分子量為324 81.6，等電點為5.34。

氨基酸序列經SignalP3.0在線分析無信號肽序列，證明其不是分泌蛋白。第1-114個氨基酸為Basic domain（堿性結構），第109-165個氨基酸為Helix-Loop-Helix domain（螺旋-環-螺旋結構），第199-213個氨基酸為周期蛋白依賴性蛋白激酶4（CDK4）結合區域，第233-249為Helix III結構（圖1）。

圖1 紅羅非魚MyoD基因開放閱讀框序列及其推測的氨基酸序列

用 Swiss model對MyoD蛋白的二級結構進行預測，結果為螺旋-環-螺旋二聚體（圖2）。

圖2 MyoD蛋白的二級結構

根據紅羅非魚，尼羅羅非魚（ID：GU246715），奧利亞羅非魚（ID：AF270790），斑馬魚（Danio rerio ID：AF318503），鯉魚（ID：AB012882），長絲裂腹魚（Schizothorax dolichonema，ID：KC184122），藍鯰魚（Ictalurus furcatus，ID：AY562555），點帶石斑魚（Epinephelus coioides，ID：HM190250），黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco，ID：HM363525），大西洋鱈魚（Gadus morhua，ID：AF329903），虹鱒（Oncorhynchus mykiss，ID：X75798），白鯰魚（Ameiurus catus，ID：AY562556）等魚類的MyoD cDNA序列，構建了系統進化樹（圖3）。結果表明，3種羅非魚聚為一支，其中紅羅非魚與尼羅羅非魚親緣關系更近。

3 討論

動物的產肉力與肌纖維的數量和生長密切相關。MyoD基因是調節肌肉生長發育的重要因子。堿性結構域和HLH結構域是MyoD保守區域。堿性結構域是HLH螺旋結構的延伸，是MyoD蛋白與DNA結合并相互作用的區域，HLH結構域能與許多其他因子相互作用，是調控的重要區域。本研究對紅羅

非魚MyoD基因進行了克隆和序列分析。該基因開放閱讀框長903 bp，編碼300個氨基酸，有典型的bHLH結構，其中堿性結構域為第1-114個氨基酸，HLH結構域為第109-165個氨基酸。不同物種之間的MyoD基因序列非常保守，與尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚的同源性達到99%，與人MyoD基因的同源性有56%。表明MyoD蛋白在生物進化過程中的保守性。 MyoD基因不存在信號肽，這與其在肌肉組織中特異性表達相符，也與該基因的bHLH結構域始于第一氨基酸的結構特點相一致［17］。

圖3 基于MyoD cDNA序列構建的系統進化樹

本研究基于MyoD開放閱讀框構建的系統進化樹表明紅羅非魚與尼羅羅非魚親緣關系最近，其次是與奧利亞羅非魚，這與紅羅非魚是莫桑比克羅非魚×尼羅羅非魚雜交產生的后代有關。郭奕惠等［18，19］用線粒體Cox1基因及細胞核ITS1序列分析羅非魚的親緣關系，結果表明紅羅非魚與莫桑比克羅非魚的親緣關系比與尼羅羅非魚的近。目前莫桑比克羅非魚MyoD基因序列還未公布，無法通過該基因序列鑒定紅羅非魚、莫桑比克羅非魚以及尼羅羅非魚的親緣關系。MyoD所反映的不同魚類之間的親緣關系基本符合傳統分類，如鯉魚、斑馬魚和長絲裂腹魚均為鯉科魚類聚集在一支，鯰魚和與黃顙魚成一支，羅非魚與石斑魚的親緣關系比與其他魚類的近。

盧中華等［12］證實在奧利亞羅非魚和尼羅羅非魚有兩種MyoD基因（MyoD1和MyoD2）存在，其中MyoD1基因開放閱讀框長903 bp，編碼300個氨基酸，MyoD2基因的基因開放閱讀框長792 bp，編碼263個氨基酸，由此可推測本研究克隆得到的紅羅非魚MyoD基因為MyoD1。

4 結論

本研究成功克隆了紅羅非魚肌肉生長發育相關的候選基因——MyoD，并對其cDNA序列和推導的氨基酸序列進行了分析，找到了該基因的堿性結構域和bHLH結構域，為開展該基因在紅羅非魚生長發育過程的作用及與性狀的關聯等研究奠定了基礎。

［1］Rawls A, Valdez MR, Zhang W, et al. Overlapping functions of the myogenic bHLH genes MRF4 and MyoD revealed in double mutant mice［J］. Development, 1998, 125（13）：2349-2358.

［2］Lassar AB, Buskin JN, Lockshon D, et al. MyoD is a sequence-specific DNA binding protein requiring a region of myc homology to bind to the muscle creatine kinase enhancer［J］. Cell, 1989, 58（5）：823-831.

［3］Blackwell TK, Weintraub H. Differences and similarities in DNA-binding preferences of MyoD and E2A protein complexes revealed by binding site selection［J］. Science, 1990, 250（4984）：1104-1110.

［4］Te Pas MF, Verburg FJ, Gerritsen CL, et al. Messenger ribonucleic acid expression of the MyoD gene family in muscle tissue at slaughter in relation to selection for porcine growth rate［J］. Journal of Animal Science, 2000, 78（1）：69-77.

［5］Lee H, Habas R, Abate-Shen C. MSX1 cooperates with histone H1b for inhibition of transcription and myogenesis［J］. Science, 2004, 304（5677）：1675-1678.

［6］Davis RL, Weintraub H, Lassar AB. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts［J］. Cell, 1987, 51：987-1000.

［7］Kobiyama A, Nihei Y, Hirayama Y, et al. Molecular cloning and developmental expression patterns of the MyoD and MEF2 families of muscle transcription factors in the carp［J］. Journal of Experimental Biology, 1998, 201（20）：2801-2813.

［8］Tan X, Du SJ. Differential expression of two MyoD genes in fast and slow muscles of gilthead seabream（Sparus aurata）［J］. Dev Genes Evol, 2002, 212（8）：207-217.

［9］于凌云, 白俊杰, 葉星, 等. 大口黑鱸 MyoD cDNA 的克隆和序列分析［J］. 生物技術通報, 2008（S1）：301-306.

［10］Wang L, Bai J, Luo J, et al. Molecular cloning and expression of grass carp MyoD in yeast Pichia pastoris［J］. Journal of Bioche-

mistry and Molecular Biology, 2007, 40（1）：22-28.

［11］Chen YH, Liang CT, Tsai HJ. Expression, purification and DNA-binding activity of tilapia muscle specific transcription factor, MyoD, produced in Escherichia coli［J］. Comparative Biochemistry and Physiology Part B：Biochemistry and Molecular Biology, 2002, 131（4）：795-805.

［12］盧中華, 俞菊華, 李紅霞, 等. 奧利亞羅非魚, 尼羅羅非魚MyoD1 和 MyoD2 基因特征及差異［J］. 中國水產科學, 2010, 17（5）：903-912.

［13］Hall TE, Cole NJ, Johnston IA. Temperature and the expression of seven muscle-specific protein genes during embryogenesis in the Atlantic cod Gadus morhua L［J］. J Exp Biol, 2003, 206（18）：3187-3200.

［14］Petersen TN, Brunak S, von Heijne G, et al. SignalP 4.0：discriminating signal peptides from transmembrane regions［J］. Nature Methods, 2011, 8（10）：785-786.

［15］Kiefer F, Arnolol K, Künzli M, et al. The SWISS-MODEL Repository and associated resources［J］. Nucleic Acids Research, 2009, 37（Suppl.1）：D387-D392.

［16］Tamura K, Dudley J, Nei M & Kumar S. MEGA4：molecular evolutionary genetics analysis（MEGA）software version 4.0［J］. Molecular Biology and Evolution, 2007, 24（8）：1596-1599.

［17］Soleimani VD, Yin H, Jahani-Asl A, et al. Snail regulates MyoD binding-site occupancy to direct enhancer switching and differentiation-specific transcription in myogenesis［J］. Molecular Cell, 2012, 47（3）：457-468.

［18］郭奕惠, 喻達輝, 黃桂菊, 等. 中國主要養殖羅非魚親緣關系的COI序列分析［J］. 華中農業大學學報, 2009（1）：75-79.

［19］郭奕惠, 喻達輝, 黃桂菊, 等. 細胞核rDNA序列分析5種羅非魚的親緣關系［J］. 安徽農業科學, 2009, 37（8）：3444-3447.

（責任編輯 李楠）

Cloning and Sequence Analysis of MyoD Gene in Red Tilmpa Oreochromis sp.（O.mossambicus×O.niloticus）

Guo Yihui Fan Sigang Huang Guiju Zhu Kecheng Yu Dahui
（Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation & Utilization，Ministry of Agriculture；South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Guangzhou 510300）

As a member of myogenic regulatory factors（MRFs）, MyoD play a positive regulation in the process of muscle proliferating. In this study, MyoD cDNA of Red Tilmpa Oreochromis sp.（O.mossambicus×O.niloticus）was obtained using homology cloning strategy and rapid cDNA end amploification. The results showed that the open reading frame（ORF）of MyoD was 903 bp length and encoded 300 amino acids, including basic helix-loop-helix（bHLH）domain which composed of 1stto 114thamino acids and 109thto 165thamino acids, CDK4 combined structure（199thto 213th）and Helix III structure（233thto 249th）. The signal peptide was not detected in MyoD. The secondary structure of MyoD protein is HLH dimmer. The phylogenetic trees was constructed based on some fish MyoD ORF and suggested that Oreochromis sp. O. aureaus and O. niloticus were clustered together firstly.

MyoD Sequence analysis Cloning Red Tilmpa（Oreochromis sp.）

2014-04-16

農業部水生動物遺傳育種和養殖生物學重點實驗室開放研究基金項目（BM2007-02），中國水產科學研究院水產種質資源與養殖技術重點開放實驗室開放基金項目（2006A003）

郭奕惠，女，助理研究員，研究方向：魚類功能基因；E-mail：yihuiguoedith@163.com

喻達輝，男，博士，研究員，研究方向：分子遺傳育種；E-mail：pearlydh@163.com