一株產纖維素酶細菌的分離鑒定及酶學特性研究

賈博涵 周偉 趙羅迪 楊埔 茍敏

（四川大學建筑與環境學院，成都 610065）

一株產纖維素酶細菌的分離鑒定及酶學特性研究

賈博涵 周偉 趙羅迪 楊埔 茍敏

（四川大學建筑與環境學院，成都 610065）

從采集的含腐爛樹葉的土壤中，篩選到1株產纖維素酶能力較高的菌株JJ-3，經16S rRNA基因序列分析，鑒定該菌株為產酸克雷伯氏桿菌（Klebsiella oxytoca）。產酶條件及酶學特性研究表明：以濾紙為碳源、蛋白胨為氮源、初始pH為8.0的培養基中發酵3 d更利于纖維素酶的合成；菌株發酵液在中性和堿性條件下均有較高的濾紙酶活力，分別可達118.7 U/mL（pH7.0），167.8 U/mL（pH8.0）和120 U/mL（pH9.0）；所產纖維素酶的最適酶反應pH為7.0，最適酶反應溫度為40℃，對溫度比較敏感，在pH7.0-8.0的范圍內具有較好的穩定性，能滿足中性和堿性纖維素酶的要求。

纖維素酶 產酸克雷伯氏桿菌 產酶條件 酶學特性

利用秸稈等纖維素類生物質生產清潔能源及化工原料，可有效地緩解環境污染與能源危機的雙重壓力［1］。利用微生物產生的纖維素酶來轉化纖維素成可發酵利用的還原糖，是纖維素資源化的有效途徑。現有的纖維素酶大多來源于真菌和放線菌，這類菌繁殖周期長，且多產酸性纖維素酶［2］。

細菌產生的纖維素酶一般為中性或者堿性酶，因為其對天然纖維素的水解能力較弱，因此對其重視不夠。近年來，隨著中性和堿性纖維素酶在洗滌、造紙、紡織和廢水處理等行業的成功應用，細菌纖維素酶已顯示出良好的經濟價值［3］。然而，現有細菌纖維素酶的研究和應用還處于起步階段，需求量較大，而且其水解活力較低，反應成本高，難以實現工業化［4］。因此，篩選優良的產纖維素酶的細菌資源對實現纖維素資源化具有重要意義。本研究從采集的含腐爛樹葉的土壤中篩選產纖維素酶能力高的菌株，旨在為獲得中性和堿性纖維素酶的菌株提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 菌株分離自四川大學江安校區內幾處腐爛樹葉下的表層土壤。

1.1.2 培養基 富集培養基：玉米秸稈1 g，濾紙1 g，報紙0.5 g，（NH4）2SO40.2 g，酵母粉0.05 g，NaCl 0.5 g，KH2PO40.4 g，CaCl2·6H2O 0.45 g，MgSO4· 7H2O 0.03 g，蒸餾水100 mL，pH調至8.0，滅菌。

初篩培養基：羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）0.2 g，（NH4）2SO40.2 g，酵母粉0.05 g，NaCl 0.5 g，KH2PO40.4 g，CaCl2·6H2O 0.45 g、MgSO4·7H2O 0.03 g，瓊脂2 g，蒸餾水100 mL，pH調至8.0，滅菌。

發酵產酶培養基：CMC-Na 0.2 g，（NH4）2SO40.2 g， 酵 母 粉0.05 g，NaCl 0.5 g，KH2PO40.4 g，CaCl2·6H2O 0.45 g、MgSO4·7H2O 0.03 g，Tween-80 0.02 g，蒸餾水100 mL，pH調至8.0，滅菌。

1.2 方法

1.2.1 纖維素酶產生菌的分離鑒定

1.2.1.1 纖維素酶產生菌的富集 配制0.9%（W/V）的NaCl溶液100 mL，將采集的土壤樣品混合均勻后懸浮于NaCl溶液中，并于30℃、150 r/min條件下振蕩2 h。取10 mL靜置后的上清液接種至100 mL富集培養基中培養3 d（30℃，150 r/min），再取10 mL培養液接種到新鮮培養基中繼續培養，重復多次富集。

1.2.1.2 纖維素酶產生菌的篩選 用水解圈初篩，發酵復篩相結合的方法進行纖維素酶產生菌的篩選。將富集培養液涂布到初篩培養基平板上進行菌種分離，并采用剛果紅染色法進行初篩，挑選能夠產生較大透明圈的菌株。將初篩菌株接種到發酵產酶培養基中，測定濾紙酶活性，取酶活最大的菌株（命名為JJ-3）進一步研究。

1.2.1.3 菌株鑒定及16S rRNA基因序列分析 菌株JJ-3的種屬鑒定由上海生工完成，并將菌株的16S rRNA 基因序列提交到GenBank數據庫。利用軟件Clustal X1.8進行多序列比對后［5］，采用軟件MEGA-3.1構建菌株JJ-3的系統發育樹，構樹方法為鄰連法（Neighbor-Joining），bootstrap 檢測1 000 次［6］。

1.2.2 菌株JJ-3產酶條件的優化

1.2.2.1 碳源對菌株產酶能力的影響 以1%（W/V）的 CMC-Na、濾紙、微晶纖維素、玉米秸稈和葡萄糖為唯一碳源的發酵產酶培養基中，分別接種菌株JJ-3，發酵培養3 d，測定濾紙酶活性。

1.2.2.2 氮源對菌株產酶能力的影響 以1%（W/V）的濾紙為唯一碳源，在液體發酵培養基中分別加入0.25%（W/V）的不同氮源（硝酸鉀、酵母粉、蛋白胨、尿素和硫酸銨），接種菌株JJ-3發酵培養3 d，測定濾紙酶活性。

1.2.2.3 培養基pH對菌株產酶能力的影響 以濾紙和蛋白胨為唯一碳氮源，調節發酵培養基的初始pH為5.0-9.0，分別接種菌株JJ-3發酵培養3 d，測定濾紙酶活性。

1.2.2.4 發酵時間對菌株產酶能力的影響 以濾紙和蛋白胨為唯一碳氮源，調節發酵培養基的初始pH為8.0，接種菌株JJ-3分別發酵培養1-5 d，測定濾紙酶活性。

1.2.3 菌株JJ-3的濾紙酶酶學特性

1.2.3.1 溫度對酶活的影響及酶的熱穩定性 將測定濾紙酶酶活的水浴反應溫度分別設定為30℃-70℃，其它條件同1.2.4的方法測定酶活，以最高值為100%，獲得濾紙纖維素酶在不同pH條件下的相對酶活力。將粗酶液分別置于上述溫度中處理1 h后，測定剩余酶活力，以未處理的粗酶液作為對照，評價纖維素酶的熱穩定性。

1.2.3.2 pH對酶活的影響及酶的pH穩定性 利用磷酸緩沖液把濾紙酶酶活測定中底物溶液的pH 調節為4.0-9.0，其它條件同1.2.4的方法測定酶活，以最高值為100%，獲得濾紙纖維素酶在不同溫度下的相對酶活力。將粗酶液分別置于pH為4.0-9.0的磷酸緩沖溶液中處理1 h后，加入濾紙測定剩余酶活力，以未處理的粗酶液作為對照，評價纖維素酶的pH穩定性。

1.2.4 纖維素酶活力的測定 菌株JJ-3以8%的接種量接種到發酵產酶培養基中，于30℃、150 r/min培養3 d，取發酵液于4 000 r/min離心20 min，取上清（粗酶液）測定纖維素酶活性。通常采用濾紙纖維素酶（FPase）來衡量纖維素菌酶系的綜合降解能力［7］。以濾紙為底物，應用二硝基水楊酸法在540 nm處測定吸光度值，每組做3個平行樣，計算

FPase活力［7］。在上述條件下，每分鐘由底物生成1 μmol還原糖所需酶量定義為一個酶活力單位，用U/mL表示。

2 結果

2.1 纖維素酶產生菌的分離與鑒定

采用水解圈初篩，發酵復篩的方法從土壤中分離到6株產纖維素酶的菌株，其中菌株JJ-3合成纖維素酶的能力最高（平板培養3 d后，菌落直徑為0.6 cm，透明圈直徑1.3 cm，復篩時酶活為38.5 U/mL），作為后續研究的對象。

在固體培養基上，菌株JJ-3的菌落呈圓形，表面光滑，隆起，邊緣整齊，半透明，灰白色。經鑒定，該菌株的16S rRNA基因序列與產酸克雷伯氏桿菌（Klebsiella oxytoca）具有99%的序列相似性。將該序列登錄GenBank，獲得序列號為KJ801560，菌株JJ-3的系統發育位置見圖1。

圖1 菌株Klebsiella oxytoca JJ-3的系統發育樹

2.2 菌株JJ-3發酵條件的優化

2.2.1 碳源對菌株產酶能力的影響 在液體產酶培養基中，分別以1%的 CMC-Na、濾紙、微晶纖維素、玉米秸稈和葡萄糖為唯一碳源，對菌株JJ-3進行發酵培養。圖2-A顯示，上述底物存在時，菌株JJ-3都具有纖維素酶活，以濾紙為唯一碳源時FPase活性最高（59.8 U/mL），其次為葡萄糖、玉米秸稈、微晶纖維素和CMC-Na。

2.2.2 氮源對菌株產酶能力的影響 考察了不同氮源（硝酸鉀、酵母粉、蛋白胨、尿素和硫酸銨）對菌株JJ-3產纖維素酶的影響。圖2-B顯示，以蛋白胨為氮源可獲得最大的FPase活性（182.8 U/mL），其次是酵母粉；以硝酸鉀和硫酸銨為氮源時，FPase活性分別只有以蛋白胨為氮源時的17%和24.8%；尿素存在時幾乎沒有FPase活性。

2.2.3 培養基pH對菌株產酶能力的影響 菌株JJ-3在不同pH值（5.0-9.0）的液體發酵培養基中培養，3 d后測定各自的纖維素酶活力。圖2-C表明，菌株JJ-3在pH值為5.0-9.0的培養基中生長時，均具有一定的FPase酶活性，中性和弱堿性條件更有利于獲得高活性的FPase，pH值為8.0時纖維素酶活性最高（167.8 U/mL），其次是pH值為9.0時的120 U/mL和pH值為7.0時的118.7 U/mL。

2.2.4 發酵時間對菌株產酶能力的影響 菌株JJ-3在以濾紙為碳源、蛋白胨為氮源、pH值為8.0的液體發酵培養基中培養不同的天數，確定最佳的發酵時間。圖2-D顯示，培養時間對FPase活性影響較大，發酵3 d和4 d時具有最大的FPase活性（約104 U/mL），繼續發酵則活性迅速降低，因此確定3 d是最佳的發酵時間。

2.3 菌株JJ-3的濾紙酶酶學特性

2.3.1 溫度對酶活的影響及酶的熱穩定性 溫度對FPase酶反應的影響（圖3）顯示，FPase在30℃-50℃范圍內具有一定活性，40℃為其最適酶反應溫

度；溫度升高到50℃時，剩余酶活僅為33.1%；溫度繼續升高，FPase活性被完全抑制。粗酶液在不同溫度保溫1 h后FPase活性均有不同程度的下降，其熱穩定性與溫度對酶反應的影響具有相同的趨勢（圖3），表明菌株JJ-3的纖維素酶對溫度比較敏感。

圖2 菌株JJ-3的發酵條件優化

圖3 溫度對酶活的影響及酶的熱穩定性

2.3.2 pH對酶活的影響及酶的pH穩定性 pH對FPase酶反應的影響（圖4）顯示，FPase在pH值為5.0-8.0的范圍內具有一定活性，pH值為7.0時酶活性最高，當pH為9.0時酶活性被完全抑制，表明菌株JJ-3的纖維素酶在中性環境能更好地降解纖維素。此外，菌株JJ-3的纖維素酶對酸有一定的耐受能力。用不同的pH緩沖液處理粗酶1 h后，在pH值為7.0-8.0的范圍內仍有50%-53%的纖維素酶活，表現出較好的穩定性，而當pH＞8.0時FPase活性完全喪失（圖4）。

3 討論

從自然界篩選高效的纖維素酶生產菌是實現纖維素資源化的前提和基礎。剛果紅平板法是最常用的識別產纖維素酶菌株的方法，具有直觀、快捷的優勢。一般認為，纖維素酶活性與剛果紅染色的透明水解圈大小（或者水解圈與菌落的直徑比值Hc）呈正比，且水解圈出現越早，產酶越快。但也有研

究表明：不同菌株的最佳產酶條件存在差異，即使同一菌株在液體培養和固體培養時也表現出不同的生理特性，透明圈無法完全代表菌株的產酶能力［8］。因此，水解圈篩選后的液體發酵或濾紙條崩解等復篩驗證過程必不可少［9］。采用水解圈初篩，發酵復篩的方法，本研究從校園土壤中獲得一株擁有較高纖維素酶活力的產酸克雷伯氏桿菌。產酸克雷伯氏桿菌屬于革蘭氏陰性菌，多數研究認為該菌具有固氮能力［10］，但對其降解纖維素的探討僅有零星報道。如蔡燕飛［11］從環境中分離出一株產酸克雷伯氏桿菌株，對香蕉桿具有一定的降解效果。Wood等［12］發現產酸克雷伯氏桿菌具有較好耐糖能力，因此利用其分解纖維素產生的葡萄糖來合成重要的化工原料2，3-丁二醇。因此，本研究獲得的菌株可為纖維素的利用提供有效的微生物資源。

圖4 pH對酶活的影響及酶的pH穩定性

不同微生物生產纖維素酶的條件不同，因此優化培養條件是提高纖維素酶產量的最直接有效途徑。據報道，大多數微生物來源的纖維素酶需要底物的誘導才能產生，而且容易利用碳源的存在（如葡萄糖等）會抑制纖維素酶的合成［13］。但菌株JJ-3以CMC-Na、濾紙、微晶纖維素、玉米秸稈和葡萄糖為唯一碳源時，均檢測到一定的纖維素酶活性。而且以葡萄糖為碳源時具有較好的纖維素酶活性（49.1 U/mL），說明葡萄糖對纖維素酶的合成并未表現出阻遏作用。這些結果推測菌株JJ-3的纖維素酶可能為組成型表達，韓如旸等［14］報道菌株Clostridium sp. EVA1產生的纖維素酶也有類似結果。研究發現氮源對菌株JJ-3產酶能力的影響較大，蛋白胨是最佳的氮源，尿素幾乎完全抑制了纖維素酶的生成，說明有機氮源比無機氮源更有利于纖維素酶的合成。也有研究發現纖維素降解菌Penicillium decumbens L-06的FPase活性在以蛋白胨為氮源時最高［15］。尿素為氮源會大大抑制Aspergillus sp. YN1中FPase的合成［16］。菌株JJ-3在不同pH值的發酵培養基中（5.0-9.0）均可合成纖維素酶，但中性和弱堿性條件獲得的FPase活性更高，基本具備作為中性和堿性纖維素酶的要求。酶學特性顯示菌株JJ-3合成的纖維素酶屬于中溫酶，在中性和弱堿性范圍內表現出較好的穩定性，但對溫度非常敏感。因此，后續研究可通過誘變或基因工程手段，來提高其對環境條件的耐受能力，以保證其在纖維素資源化中的應用。

4 結論

以秸稈、濾紙和報紙為原料，經水解圈初篩和發酵復篩，從校園含腐爛樹葉的土壤中獲得一株生產纖維素酶的細菌菌株，鑒定其為產酸克雷伯氏桿菌（Klebsiella oxytoca），GenBank登錄號為KJ801560。產酶條件優化結果顯示：菌株JJ-3的纖維素酶可能為組成型表達，無需底物誘導就能產生；有機氮源和中性或堿性條件更利于纖維素酶的合成；且最優產酶條件如下：碳源為濾紙，氮源為蛋白胨，培養基初始pH為8.0，發酵3 d。酶學特性結果顯示：FPase的最適酶反應溫度為40℃，對溫度比較敏感；最適酶反應pH為7.0，在pH值為7.0-8.0的范圍內仍有50%-53%的纖維素酶活，表現出較好的穩定性，基本滿足中性和堿性纖維素酶的要求。

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（責任編輯 馬鑫）

Isolation，Identification and Enzymatic Characterization of a Cellulase-Producing Bacteria

Jia Bohan Zhou Wei Zhao Luodi Yang Pu Gou Min
（College of Architecture and Environment，Sichuan University，Chengdu 610065）

A cellulase-producing bacteria strain JJ-3 with high activity was isolated from the soil containing rotted leaves, which was identified as Klebsiella oxytoca based on the 16S rRNA sequence analysis. The optimal enzyme-producing conditions of strain JJ-3 was investigated and was as follows：filter paper as carbon source, peptone as nitrogen source, pH8.0, three-day fermentation. And the fermentation culture had higher FPase activity under neutral and alkaline conditions, with 118.7 U/mL（pH7.0）, 167.8 U/mL（pH8.0）, 120 U/mL（pH9.0）. The results of enzymatic characterization showed that the optimal pH and temperature for enzyme reaction was 7.0 and 40℃, respectively. FPase was sensitive to temperature, while it kept good stability during the pH7.0 to 8.0. This study suggested that the cellulase from strain JJ-3 meets the request of neutral and alkaline cellulase.

Cellulase Klebsiella oxytoca Enzyme-producing conditions Enzymatic characterization

2014-05-21

國家自然科學基金項目（31200068）

賈博涵，男，研究方向：環境微生物工程；E-mail：jiabohanscu@163.com

茍敏，女，博士，碩士生導師，研究方向：有機廢棄物資源化；E-mail：gouminscu@163.com