PPARβ/δ激動劑GW501516對人角質形成細胞增殖、遷移和粘附的影響

胡小平 張 偉 陳辦成 陳史宏 王勇強 于 波

·論著·

PPARβ/δ激動劑GW501516對人角質形成細胞增殖、遷移和粘附的影響

胡小平 張 偉 陳辦成 陳史宏 王勇強 于 波

目的: 評價過氧化物酶體增殖物激活受體β/δ(PPARβ/δ)的激動劑GW501516對人角質形成細胞(KC)增殖、遷移和粘附的影響。方法: 體外培養正常人KC，采用MTT比色法及體外計數法，觀察正常人KC在不同濃度GW501516(0，1，5，10，25，50，100 ng/m l)作用下，其增殖、遷移及粘附情況。結果: 與對照組比較，GW501516促進KC增殖(P＜0.01)，呈劑量依賴性；GW501516顯著促進了KC的遷移(P＜0.001)；細胞粘附性與對照組間無統計學差異(P＞0.05)。結論: GW501516能夠促進人KC增殖和遷移，對KC粘附無影響。

過氧化物酶體增殖物激活受體； GW501516； 角質形成細胞； 增殖； 遷移； 粘附

過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferator－activated receptors，PPARs)是一類激素核受體超家族成員。現已證實有三種不同的PPARs亞型:PPARα、PPARβ/δ、PPARγ。近年來，對于PPARs和炎癥性皮膚病的關系受到了學者們的關注。1而人皮膚角質形成細胞(keratinocytes，KC)中，PPARβ/δ是主要的亞型。研究發現PPARβ/δ在增殖的HaCaT細胞和銀屑病皮損中表達明顯上升，2提示PPARβ/δ可能和KC增殖具有一定的關系。為進一步了解PPARβ/δ對KC的影響，我們選擇PPARβ/δ的激動劑GW501516和KC體外共同培養，研究PPARβ/δ激活后對KC的增殖、遷移和粘附功能作用的影響。

1 材料和方法

1.1 組織標本和材料 15名正常人(19～58歲)健康皮膚來自我院皮膚科和整形外科，均按照知情同意的原則留取組織標本。無血清KC培養基(KSFM，含5μg/mL的慶大霉素)，0.5%dispase分離酶(Gibco，美國)，胎牛血清、0.25%胰酶/EDTA(Peprotech，美國)；GW501516試劑(上海浩天然生物技術有限公司)；MTT；二甲基亞砜(DMSO，Solarbio，美國)；其他試劑及器材:T－75培養瓶(Fluka，UK)、細胞計數板、12孔板、96孔板(Costar，美國)等。

1.2 表皮KC的分離和培養 無菌手術后保存在0.5%dispase分離酶中的正常人皮膚標本在4℃過夜后，無菌操作臺中分離表皮和真皮。將分離下的表皮置于0.25%的胰酶中，37℃靜置10 min。然后以胎牛血清中止胰酶的活性，輕輕吹打表皮，以200目濾網過濾KC懸液，1000 r/min離心7min。然后，棄上清，加入KSFM，將正常表皮KC種植于T－75培養瓶中，37℃，5%CO2培養、傳代，所有的實驗均利用2～3代對數生長期的KC。

1.3 MTT法檢測GW501516對KC增殖的影響MTT法參照文獻，3略加改變。對數生長期KC用胰酶/EDTA消化后重懸于KSFM，以5×104/mL密度種植于96孔板，每孔100μL。放置于培養箱中，細胞鋪滿孔底部60%～70%后，棄培養基，然后用PBS沖洗兩次。加入100μL含有不同濃度GW 501516(0、1、5、10、25、50、100 ng/m L)的基礎KSFM中，繼續孵育48 h。最后每孔加入2μL用PBS配置的MTT(5mg/ mL)。放置于孵箱中3 h后，棄除培養基，加入100 μL DMSO后置于水平振蕩器上振蕩，然后置于分光光密度儀570 nm讀取吸光度值。每種處理因素均設6復孔，重復3次，結果取平均值，以均數±標準差表示。

1.4 細胞遷移實驗檢測GW 501516對KC遷移能力的影響 細胞遷移實驗參照既往的研究方法，4略加改變。改良Boyden chambers中裝入8μm孔徑的PVP膜，PVP膜光滑面預先用20μg/mL IV型膠原40℃預孵育24 h并在室溫下風干，光面向下。趨化盒的下層每孔加入27μL含有不同濃度GW 501516 (0、1、5、10、25、50、100 ng/mL)的基礎KSFM，上層加入50μL密度為5×104/m L的基礎KSFM混懸的HaCaT細胞懸液。放置于培養箱中12 h后，取出PVP膜，小心刮去正面的非遷移性的細胞，保留朝下的光滑面的細胞，4%多聚甲醛固定10 min，2%結晶紫染色5 min后流水沖洗，在光鏡400×放大倍數每孔隨機取5個視野計數遷移到光滑面的細胞，5個視野計數之和代表每孔的細胞遷移數目。每種處理因素均設3復孔，重復3次，結果取平均值，以均數±標準差表示。

1.5 細胞粘附實驗檢測GW 501516對正常表皮KC粘附能力的影響 對數生長期KC用胰酶/EDTA消化后用PBS沖洗2次后重懸于基礎無血清KC培養基，以1×105/mL密度種植于20μg/mL IV型膠原預包被的96孔板，每孔100μL，同時加入不同濃度GW 501516(0、1、5、10、25、50、100 ng/mL)，在培養箱中繼續培養4 h。最后棄培養基，然后用37℃預熱的無血清KC培養基輕輕沖洗3次以去除未粘附的細胞，每孔加入20μL用PBS配置的MTT(5 mg/mL)，放置于培養箱中3 h后，加入100μLDMSO后水平振蕩器振蕩5min后，置于分光光密度儀570 nm讀取吸光度。每種處理因素均設6復孔，重復3次，結果取平均值，以均數±標準差表示。

1.6 統計學方法 數據采用ˉx±s表示，多組均值間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用配對t檢驗，P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

GW501516呈劑量依耐性的促進KC增殖，50 ng/ mL時達到峰值。GW501516能顯著促進KC的遷移，濃度在100 ng/mL時約是對照組的11倍。GW501516對KC粘附作用無影響(P＞0.05)。見表1、圖1～3。

圖1 GW501516對KC促增殖效應。GW501516呈劑量依耐性的促進KC增殖，50 ng/mL時達到峰值。?表示在GW501516處理組和未處理組之間具有統計學意義(?:P＜0.05；???:P＜0.001)

圖2 GW501516對KC遷移的影響。GW501516能顯著促進細胞的遷移。???表示在GW501516處理組和未處理組之間有統計學意義(P＜0.001)

圖3 GW501516對KC粘附作用的影響

表1 GW501516對正常KC增殖、遷移和黏附的影響

3 討論

一系列研究發現，PPARs被相應的激動劑活化后，在皮膚和其他器官中可調節重要的細胞功能，這些新的功能支持PPARs和相應激動劑可作為治療不同皮膚病的潛在靶位。5人皮膚KC中，PPARβ/δ是主要的亞型，已有研究認為PPARβ/δ與表皮分化有關。6盡管內源性PPARβ/δ配體激動劑的本質仍不清楚，但幾種化學合成的激動劑如GW 501516已在研究PPARβ/δ生理功能的科學實驗中被廣泛應用。

在已發表的研究中，PPARβ/δ對表皮的增殖作用存在爭議，一些研究認為PPARβ/δ的激活促進了表皮細胞的增殖，7而另一些研究認為其活化后會抑制表皮細胞增殖。8，9近年來，在一些KC增生性疾病中如銀屑病皮損中發現PPARβ/δ表達明顯增加，2并且小鼠體內實驗發現PPARβ/δ活化能夠觸發銀屑病特征性的免疫反應，引起銀屑病樣皮膚損害。10這些研究似乎更傾向于表明PPARβ/δ的激活具有促進表皮KC增殖作用。Tan等研究發現，PPARβ/δ在皮膚傷口愈合過程中有重要的作用，11表明PPARβ/δ活化促進了表皮細胞的遷移功能。對于這些研究現象的爭議，目前的解釋認為:細胞中PPARβ/δ活化可能存在雙相反應，這種反應主要依賴于炎癥信號所誘發的變量情況，即在炎癥刺激作用下，PPARβ/δ表現為促進細胞增殖作用，而在非炎癥情況下表現為抑制細胞增殖功能。

本研究發現PPARβ/δ在激動劑GW 501516的活化下，對正常KC具有明顯的促增殖和遷移作用，而對細胞粘附功能無影響，實驗結果支持了PPARβ/δ促增殖和遷移的功能，但炎癥刺激理論并不能解釋這種正常情況下的PPARβ/δ所產生的促增殖和遷移的效應，但由于實驗中使用了外源性激動劑GW501516，可能也說明體外實驗的結果并不能真實反映PPARβ/δ在體內時的實際功能，因為需要對PPARβ/δ產生作用的機理進一步深入研究。近期發現了一種新的KC增殖和分化穩態控制路徑，即PPARβ/δ憑借調節皮膚成纖維細胞的IL－1信號，12為解釋此現象帶來了希望。

本研究結果顯示，PPARβ/δ促進KC增殖和遷移功能與激動劑GW501516的工作濃度呈劑量依耐性，這說明激動劑的濃度大小影響和調節了PPARβ/δ的促增殖和遷移效應，這可能從另外角度說明正常非炎癥情況下，雖然表皮KC細胞中有PPARβ/δ的表達，但由于無激動劑活化，PPARβ/δ不會促進正常的KC細胞增殖和遷移。這也間接支持了炎癥狀態下PPARβ/δ的促增殖效應。另外，研究結果顯示PPARβ/δ對KC的粘附作用無影響，而粘附功能在炎癥因子趨化過程中發揮重要作用，這提示PPARβ/δ可能對炎癥過程無調節作用。

總之，結合相關研究，13說明PPARβ/δ在調節細胞存活、增殖和遷移以及修復等方面具有重要作用，尤其可能在增殖性炎癥性皮膚病發病機制中有重要影響，表明其將來可能成為治療此類疾病的藥物作用靶點。

1 Sertznig P，Reichrath J.Peroxisome proliferator－activated receptors(PPARs)in dermatology:challenge and prom ise.Dermatoendocrinol，2011，3(3):130－135.

2 El EishiN，Hegazy R，Abou Zeid O，etal.Peroxisome proliferator receptor(PPAR)β/δin psoriatic patients before and after two conventional therapeutic modalities:methotrexate and PUVA.Eur JDermatol，2011，21(5):691－695.

3Weichert H，Blechschmidt I，Schroder S，et al.The MTT assay as a rapid test for cell proliferation and cell killing:application to human peripheral blood lymphocytes(PBL).Allerg Immunol (Leipz)，1991，37(4):139－144.

4 Zhang K，Krammer RH.Laminin 5 deposition promotes keratinocytemotility.Exp Cell Res，1996，227(2):309－322.

5 Villarrubia VG，Vidal－Asensi S，Pérez－Ba?asco V，etal.Lipid nutrition and the epidermal barrier:The connection between immune－mediated inflammatory diseases and peroxisome proliferator－activated receptors，a new therapeutic target in psoriasis and atopic dermatitis.Actas Dermosifiliogr，2010，101(7):585－599.

6 Burdick AD，Kim DJ，Peraza MA，et al.The role of peroxisome proliferator－activated receptor－beta/delta in epithelial cell growth and differentiation.Cell Signal，2006，18(1):9－20.

7Hao CM，Redha R，Morrow J，et al.Peroxisome proliferatoractivated receptor deltaactivation promotes cell survival following hypertonic stress.JBiol Chem，2002，277(24):21341－21345.

8 Burdick AD，Bility MT，Girroir EE，et al.Ligand activation of peroxisome proliferator－activated receptor－beta/delta(PPARbeta/delta)inhibits cell growth of human N/TERT－1 keratinocytes.Cell Signal，2007，19(6):1163－1171.

9 Borland MG，Foreman JE，Girroir EE，et al.Ligand activation of peroxisome proliferator－activated receptor－beta/delta inhibitscell proliferation in human HaCaT keratinocytes.Mol Pharmacol，2008，74(5):1429－1442.

10 Romanowska M，Reilly L，Palmer CN，et al.Activation of PPARbeta/delta causes a psoriasis－like skin disease in vivo. PLoSOne，2010，5(3):9701.

11 Tan NS，Michalik L，Desvergne B，etal.Genetic－or transforming growth factor－beta 1－induced changes in epidermal peroxisome proliferator－activated receptor beta/delta expression dictate wound repair kinetics.J Biol Chem，2005，280(3): 18163－18170.

12 Chong HC，Tan MJ，Philippe V，et al.Regulation of epithelial－mesenchymal IL－1 signaling by PPARbeta/delta is essential for skin homeostasis and wound healing.JCell Biol，2009，184 (6):817－831.

13 Man MQ，Barish GD，Schmuth M，et al.Deficiency of PPAR-beta/delta in the epidermis results in defective cutaneous permeability barrier homeostasis and increased inflammation.J Invest Dermatol，2008，128(2):370－377.

(收稿:2013－11－17 修回:2014－01－05)

Effects of PPARβ/δagonist GW 501516 on the proliferation，m igration and attachment of human keratinocytes in vitro

HU Xiao-ping，ZHANGWei，CHEN Ban-cheng，etal.Department ofDermatology，Shenzhen Hospital，Peking University，Guangdong，518036

Objective:To investigate the influence of peroxisome proliferator receptorβ/δ(PPARβ/δ)agonist GW501516 on the proliferation，migration and attachment of cultured human keratinocytes(KC).Methods:After the KCs were treated with different concentrations of GW 501516(0，1，5，10，25，50，100 ng/ m l)，the cell proliferation，migration and attachmentweremeasured by MTTmethod.Results:Compared with control group，GW 501516 significantly increased the cell proliferation(P＜0.001)，in a dose－dependentmanner，and markedly promoted the cellmigration(P＜0.001).There was no significant difference in the cell attachmentbetween the experimental group and control group(P＞0.05).Conclusion:The results demonstrate that GW501516 can stimulate human KC proliferation andmigaration，but has no effect on KC attachment.

peroxisome proliferator receptor；GW 501516；human keratinocytes；proliferation；migration；attachment

廣東省自然科學基金項目(編號:S2012040006694)

廣東省醫學科研基金項目(編號:B2012329)

深圳市科技計劃項目(編號:201203035)

北京大學深圳醫院皮膚科，廣東深圳，518036