1例有汗性外胚層發育不良患者的基因突變分析

蔣樹娟，黃丹，何蓉

（中國醫科大學附屬盛京醫院臨床遺傳科，沈陽110004）

1例有汗性外胚層發育不良患者的基因突變分析

蔣樹娟，黃丹，何蓉

（中國醫科大學附屬盛京醫院臨床遺傳科，沈陽110004）

Mutation Analysisin Patientwith Hidrotic EctodermalDysplasia：ACase Report

利用DNA測序技術對1例中國漢族有汗性外胚層發育不良患者進行GJB6基因突變檢測，并利用生物信息學軟件對檢測到的突變進行結構分析，明確有汗性外胚層發育不良的致病原因。結果發現，GJB6基因c.31G＞A（p.G11R）突變是該有汗型外胚層發育不良患者的致病原因之一。

有汗型外胚層發育不良；基因突變；GJB6；DNA測序；結構分析

有汗型外胚層發育不良（hidrotic ectodermal dysplasia，HED），又稱Clouston綜合征，人類孟德爾遺傳在線編號為129500，是一種罕見的常染色體顯性遺傳性皮膚疾病，發病率約為1/10萬。臨床主要特點為甲發育不良、掌跖角化、毛發稀疏或完全缺如，患者汗腺和皮脂腺功能正常，部分患者可有白內障、斜視、骨骼改變、聽力減退、智力障礙及指（趾）畸形，臨床表現具有多樣性［1］。本病是由編碼連接蛋白30（connexin 30，Cx30）的GJB6基因突變所致［2］。我們利用DNA測序技術對來門診進行遺傳咨詢的1例中國漢族有汗型外胚層發育不良患者及其父親進行了致病基因突變分析，報道如下：

1 材料與方法

1.1 臨床資料

患者男，28歲，自出生就發現頭發、指甲、趾甲發育不良。查體：無頭發，頭皮僅見少量毫毛；眉毛、睫毛、陰毛、腋毛等體毛缺如，甲板短小，指甲、趾甲發育不良、短縮、變薄，有深的縱紋（圖1A和1B），牙齒發育正常，汗腺分泌正常，視力、聽力無異常，智力發育正常，腋窩皮膚病理示表皮基本正常，真皮散在毛囊、皮脂腺結構，汗腺豐富（圖2A）。患者父親，50歲，臨床表現比患者輕，頭發、眉毛及睫毛正常，陰毛、腋毛稀少，指甲、趾甲增厚呈灰黃色（圖1C和1D），右上肢及前胸可見散在紅斑，牙齒發育正常，汗腺分泌正常，視力及聽力正常，智力發育正常，腋窩皮膚病理顯示表皮基本正常，真皮內未見毛囊、皮脂腺結構，真皮下部汗腺豐富（圖2B）。

圖1 患者及其父親甲表現

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取：經患者及家屬知情同意，采集患者及其父親的外周血，并獲得了他們簽署的知情同意書。采用上海華舜生物技術有限公司的外周血DNA抽提試劑盒提取基因組DNA。另外以同樣的方法提取160例無親緣關系的健康對照個體基因組DNA作為對照。

1.2.2 突變檢測：GJB6含有一個外顯子，我們參照文獻［3］合成引物，對GJB6整個編碼區進行擴增，產物長度990 bp。PCR反應體系為25 μL，含有基因組DNA 100 ng，引物0.5 μmol/L，1×PCR緩沖液，1 μmol/L dNTPs，1.5 μmol/L MgCl2，1U Taq DNA聚合酶（大連TaKaRa公司）。PCR反應條件：95℃變性5 min，95℃45 s，62℃45 s，72℃1 min進行35個循環，72℃延伸10 min。4 μL PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR擴增的目的片段純化回收后用ABI3730測序儀（美國Applied Biosystems by Life Technologies）進行雙向測序，測序引物同前。測序結果用DNAStar 5.0和BioEdit軟件與人類基因組GJB6序列（NG_008323.1）進行比對。

圖2 患者及其父親右腋下皮膚病理

1.2.3 Cx30結構分析：從NCBI數據庫（http：//www.ncbi.nlm. nih.gov/）下載不同種屬的Cx30序列，利用BioEdit軟件對下載的氨基酸序列進行比對，比較Cx30突變位點區域的種屬差異。瑞士生物信息學研究所創建的蛋白質分析專家系統包含了蛋白質三級結構預測的SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）數據庫，利用該網站的在線預測功能，以Cx26（PDB編碼：2ZW3）為模板對野生型和突變后的Cx30進行蛋白質三級結構預測，并進一步利用生物信息學軟件Py-MOL（http：//www.pymol.org）對突變前后的蛋白質三級結構進行比較［4］。

2 結果

2.1 GJB6基因突變分析

測序結果表明，患者及其父親攜帶GJB6基因雜合錯義突變c.31G＞A（p.G11R），該突變導致Cx30第11位氨基酸由甘氨酸（Gly）變成精氨酸（Arg），160例無親緣關系的正常人均未見此改變（圖3）。

2.2 Cx30結構分析

通過氨基酸序列比對可以看出Cx30的第11個氨基酸位置（p.G11）在各個種屬（如人、猩猩、狗、鼠、牛、雞）中高度保守（圖4A）。三級結構分析顯示，突變之前甘氨酸（Gly11）可以與Cx30氨基端的組氨酸（His7）和纈氨酸（Val13）形成氫鍵，從而維持Cx30正常的三級結構；突變成精氨酸（Arg11）之后，增加的側鏈還可以與氨基端的蘇氨酸（Thr8）和第一跨膜區的蘇氨酸（Thr26）形成氫鍵（圖4B、C），這可能會影響Cx30的正常折疊，從而影響其正常的空間構象。另外，突變為精氨酸之后Cx30氨基末端的局部區域還增加了正電荷，這可能會對Cx30正常結構的形成產生影響，或對形成的連接蛋白通道的通透性產生影響。

圖3 GJB6基因測序圖

3 討論

有汗型外胚層發育不良是一種罕見的常染色體顯性遺傳性疾病，多見于法籍加拿大人。1996年Kibar等［5］利用基因連鎖分析確定了HED2的染色體定位，2000年Lamartine等［6］進一步證實GJB6基因突變是該綜合征的致病原因。迄今為止，在HED患者中已發現該基因的4種突變：（1）大多數HED患者發病的原因是c.31G＞A（p.G11R）突變，該突變導致Cx30的氨基末端引入了一個正電荷的精氨酸。Lamartine等［6］研究了來自不同地理區域（蘇格蘭、非洲、西班牙、法裔加拿大人、法國、印度、馬來群島及威爾士）的12個患病家系，發現除了印度、馬來群島和威爾士的患者攜帶c.263C＞T突變外，幾乎所有的患者為c.31G＞A突變，這一突變還在黎巴嫩和德國患者中被發現［7］，中國也相繼在5個家系中發現這個突變［8～12］，本研究也在先證者和其父親中檢測到c.31G＞A（p.G11R）突變的存在，進一步支持此突變是導致HED發病的主要原因。（2）錯義突變c.263C＞T（p.A88V）［2］，該突變在Cx30的第2個跨膜區引入了1個高疏水性的氨基酸殘基。李汶等［13］也在一中國家系中發現此突變，并在基因診斷基礎上對該家系中一孕婦孕5個多月的胎兒進行了產前診斷。（3）第3種突變c.110T＞A（p.V37E），該突變是Smith等［14］在研究一個散發的來自蘇格蘭的病例時發現的，它直接導致了Cx30第1個跨膜區域的氨基酸的改變，引入了一個帶負電荷的谷氨酸。（4）第4種突變c.148G＞A（p.D50N），該突變發生在Cx30的第一個胞外區，是Baris等［15］在患有HED的北歐猶太人中發現的，后兩種突變尚未在中國患者中發現。

圖4 Cx30氨基末端氨基酸序列比對及三級結構分析

GJB6基因編碼Cx30蛋白，屬于縫隙連接蛋白基因家族，與相鄰細胞膜上的半通道或稱連接子組成一個完整的縫隙連接通道，使相鄰細胞間離子、代謝物質和小的信使分子直接轉運，對細胞增殖、分化及機體的生長發育具有意義［16］。據報道，Cx30在特定的組織優先表達，在小鼠中，Cx30在成鼠的大腦和皮膚中高度表達［17］。Fujimoto等［7］利用免疫染色的方法證明Cx30在毛囊、表皮和指甲中高度表達，并證明其在表皮細胞的分化、毛囊和指甲的生長過程中起到了重要的作用，由此推測突變的Cx30可能影響這些組織的增殖和分化，從而導致HED的發生。連接蛋白結構上具有相似性，每種連接蛋白都具有4個跨膜區，2個胞外區，3個胞內區，人類Cx30編碼261個氨基酸，與Cx26具有77%的同源性［18］。本研究在患者中檢測到的突變發生在Cx30的氨基末端，為了進一步明確此突變的致病機制，我們對不同種屬的氨基酸序列進行了比對，并對突變前后Cx30的三級結構進行了比較，通過氨基酸序列比對可以看出Cx30的第11個氨基酸位置（p. G11）在人、猩猩、狗、鼠、牛、雞各個種屬中高度保守。甘氨酸是只含有2個碳原子的脂肪族氨基酸，當甘氨酸被含有6個碳原子帶有正電荷的精氨酸取代后，不僅增加了側鏈的長度，還引入了能提供正電荷的氨基，三級結構分析顯示，突變之前甘氨酸（Gly11）可以與Cx30氨基端的組氨酸（His7）和纈氨酸（Val13）形成氫鍵，從而維持Cx30正常的三級結構；突變成精氨酸（Arg11）之后，增加的側鏈還可以與氨基端的蘇氨酸（Thr8）和第一跨膜區的蘇氨酸（Thr26）形成氫鍵，這可能會影響Cx30的正常折疊，從而影響其正常的空間構象。另外，突變為精氨酸之后Cx30氨基末端的局部區域還增加了正電荷，這可能會對Cx30正常結構的形成產生影響，或對形成的連接蛋白通道的通透性產生影響。

有汗型外胚層發育不良的臨床表現具有多樣性，本研究中患者主要表現為甲和毛發的異常，不伴有掌跖角化。患者和其父親的表現不盡相同，患者指、趾甲表現為甲板短小，甲發育不良、短縮、變薄，有深的縱紋，而其父親則表現為指、趾甲增厚、呈灰黃色；患者毛發損害較重，頭發及各種體毛均缺如，而其父親毛發損害較輕，除陰毛、腋毛稀少外頭發、眉毛及睫毛等均正常。同為c.31G＞A（p.G11R）突變導致的HED，文獻［8，10，12］報道的家系中患者有典型的三大癥狀（甲發育不良、掌跖角化、毛發稀疏或完全缺如）；陳楠［9］、劉寧等［11］報道的家系與本研究患者的表現相同，除了甲和毛發異常外，不伴有掌跖角化；除此之外此突變還可伴有杵狀指和或智力低下等［8，9］。同一突變在相同種族人群中導致的表型差異可能與基因突變的外顯度不同相關，或與某些未知的調節機制相關，也可能與環境因素相關。

HED臨床表現的多樣性和個體差異對臨床診斷造成困難，利用GJB6基因突變檢測方法對HED患者進行檢測能夠明確病因，從而更好地為患者提供遺傳咨詢。對Cx30蛋白結構的分析能使我們更好地理解HED的致病機制。

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（編輯 陳姜）

R394.3

A

0258-4646（2014）10-0941-04

蔣樹娟（1985-），女，博士研究生.

何蓉，E-mail：her@sj-hospital.org

2013-06-01

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