金櫻子對大鼠糖尿病性白內障細胞凋亡和氧化應激的影響

(南華大學附屬第二醫院眼科,湖南衡陽421001)

目前,糖尿病已成為嚴重影響人類健康的常見疾病之一,全球糖尿病患者約為3.70億,中國患者已接近1億,其并發癥涉及器官組織較多,如眼、腎、心、血管、神經等,對人們的生活質量影響巨大,其中最易導致失明的眼部并發癥就是糖尿病性白內障和糖尿病性視網膜病變[1],糖尿病性白內障最主要的發病機制之一就是氧化應激。研究已經表明,在白內障的形成和發展中伴隨著晶狀體上皮細胞的凋亡,而過度的氧化應激反應可加速晶狀體上皮細胞的凋亡[2]。最近的研究表明,金櫻子能清除超氧陰離子自由基,羥自由基,抑制細胞凋亡,阻止脂質過氧化,降低血清β2脂蛋白和膽固醇,降低肝臟,心臟脂肪沉積,調節血糖,具有顯著的抗氧化和抗炎作用[3],可以在一定程度上延緩大鼠糖尿病腎臟功能的損害[4]。該課題通過研究金櫻子對大鼠糖尿病性白內障細胞凋亡和氧化應激的影響,探討糖尿病性白內障的防治新途徑。

1 材料與方法

1.1 試劑與大鼠

金櫻子從衡陽中藥材公司購買;STZ、碘化丙啶從美國Sigma公司購買;膜聯蛋白V凋亡檢測試劑盒從美國BD公司購買;丙二醛(MDA)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒和總抗氧化能力檢測試劑盒(TAC)從南京建成生物工程研究所購買;其余試劑均從上海生物工程有限公司購買。Sprague Dawley(SD)大鼠從南華大學實驗動物部購買,大鼠重量為250±5 g,經散瞳實驗檢查顯示晶狀體均正常透明。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠白內障模型的建立與金櫻子干預 將60只SD大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(60 mg/kg),72 h后尾靜脈取血測量空腹血糖大于14 mmoL/L表示糖尿病模型建立成功,然后將成模的大鼠再隨機分為糖尿病模型組和金櫻子干預組,每組各30只。同時設立正常對照組SD大鼠30只。金櫻子干預組按400 mg/kg體重用金櫻子灌胃,4周、8周和12周,每組各取10只大鼠,經0.01 g/L戊巴比妥鈉麻醉處死后取晶狀體備用。

1.2.2 血糖與血脂檢測 處死大鼠前,禁食(不禁水)10 h,稱體重,末次給藥后1 h,麻醉大鼠,取腹主動脈血,離心分離血清,檢測血糖、血脂水平用半自動生化分析儀。

1.2.3 晶狀體混濁度檢測 用1%復方托吡卡胺眼液在大鼠雙眼各點1次,5 min后乙醚蒸氣麻醉,每4周用TOPCON SL-2G裂隙燈顯微鏡觀察晶狀體變化,根據Azuma等[5]的分級標準,將晶狀體混濁水平分為5個等級,Ⅰ級:無混濁,晶體透明;Ⅱ級:輕度混濁,周邊部分晶體皮質開始出現空泡樣改變;Ⅲ級:中度混濁,周邊部的空泡樣改變開始向中央發展,晶體核開始出現少量的霧樣混濁;Ⅳ級:重度混濁,晶體的空泡樣改變范圍繼續擴大并向晶體核區蔓延,出現嚴重的霧狀混濁;Ⅴ級:晶體皮質及核全部混濁。

1.2.4 分光光密度法檢測 麻醉處死大鼠后,將大鼠的晶狀體摘除,0.9%氯化鈉注射液沖洗后稱重,然后將晶狀體組織勻漿,低溫離心,取上清液,參照試劑盒說明書,分光光度法檢測晶狀體組織中TAC、MDA活性和SOD含量。

1.2.5 流式細胞儀檢測晶狀體上皮細胞凋亡 獲取大鼠晶狀體,顯微鏡下撕取晶狀體前囊膜,并用300目濾網制備成單細胞懸液,1 000 r/min離心5 min后,PBS洗滌2次,調整細胞密度為1×109/L。加入預冷的1×結合緩沖液、Annexin V-FITC液5 μL和 PI 10 μL,充分混勻,室溫避光染色 15 min,PBS洗滌多余染料后,用流式細胞儀(y=488 nm)檢測細胞凋亡率。

1.3 統計學分析

實驗數據均平行測定3次,用均數±標準差表示,所有數據采用SPSS13.0統計軟件進行分析,晶狀體混濁程度用H檢驗,計量資料組間比較采用單因素方差分析及q檢驗,以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 糖尿病大鼠的一般情況

大鼠注射STZ后1周,其喝水量、進食量及尿量均顯著增加。正常對照組大鼠體重迅速增加,但金櫻子干預組和糖尿病模型組體重增長緩慢。4周后糖尿病模型組大鼠精神不振、體重減輕、毛發干枯與脫毛,糖尿病的并發癥開始逐步顯現反應遲鈍和多發感染等。稱重發現,金櫻子干預組體重明顯較糖尿病模型組增加(表1,P＜0.05),一般情況明顯好于糖尿病模型組。12周時糖尿病模型組大鼠體重明顯低于正常對照組和金櫻子干預組(P＜0.05)。

表1 不同時間各組大鼠的體重變化(g,n=10)

2.2 血糖與血脂

正常對照組大鼠血糖值一直正常。用STZ誘發后3天,60只大鼠血糖均＞14 mmol/L,與注射前相比血糖明顯升高(P＜0.05)。誘發4周后,金櫻子干預組大鼠血糖與血脂明顯下降,而糖尿病模型組血糖與血脂繼續上升(P＜0.05);至12周時,金櫻子干預組大鼠血糖與血脂較糖尿病模型組大鼠明顯降低(表2,P＜0.05)。

表2 各組大鼠FBG、TC、TG的變化(mmol/L,n=10)

2.3 晶狀體混濁程度

正常對照組大鼠晶狀體在4～12周內一直保持透明,糖尿病模型組、金櫻子干預組大鼠在注射STZ后第4周均逐漸出現不同程度的晶狀體混濁;到12周時,糖尿病模型組大鼠大部分都出現了比較嚴重的晶狀體皮質及核的混濁,少部分的晶狀體還出現了全白色的混濁,但金櫻子干預組大鼠發生晶狀體混濁的數量及程度均較糖尿病模型組低(圖1,P＜0.05)。

圖1 晶體混濁程度分級(Ⅰ～Ⅴ級) A:Ⅰ級;B:Ⅱ級; C:Ⅲ級; D:Ⅳ級; E:Ⅴ級

2.4 晶狀體組織中TAC、SOD活性和MDA含量

與正常對照組比較,糖尿病模型組大鼠晶狀體組織MDA含量顯著增加,TAC和SOD活性則顯著降低(表3,P＜0.05);經金櫻子處理后,不但顯著降低了晶狀體組織的MDA含量,而且明顯增強了TAC和SOD的活性(見表3,P＜0.05)。說明金櫻子能夠降低脂質過氧化物,提高晶狀體組織抗氧化酶活性,提高總抗氧化力,從而降低晶狀體的氧化應激反應的影響,延緩糖尿病性白內障的發生和發展。

表3 第12周時各組晶狀體組織中TAC、SOD活性 和MDA含量(n=20)

2.5 細胞凋亡率

4周、8周和12周時糖尿病模型組細胞凋亡率均顯著高于正常對照組(見表4,P＜0.05);金櫻子干預組細胞凋亡率較糖尿病模型組顯著降低(見表4,P＜0.05)。

表4 各組LECs的凋亡率比較(%,n=20)

3 討 論

糖尿病性白內障是多種因素綜合作用的結果,其經典發病機制包括氧化應激學說、滲透壓學說以及晶體蛋白的非酶糖基化學說,在各種導致白內障的病因中都有一個相同的途徑即由自由基介導的氧化應激[6]。生理條件下,晶狀體有兩類自由基防御系統:酶防御系統(超氧化物歧化酶(SOD),過氧化氫酶(CAT),谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)及其同工酶CuZnSOD等);另一個是非酶防御系統(維生素C、E和巰基化合物等,它的主要功能是保護晶狀體蛋白巰基功能、減少H2O2和其他氧化物生成[7])。主要用于清除自由基、維持細胞和機體的正常生理功能。抗氧化防御屏障受很多因素的影響,一旦受損可以導致谷胱甘肽(GSH)、抗壞血酸,維生素C和E等的含量減少,抗氧化酶(GSH-PX、CAT、SOD)活力降低,使晶體 O2-、OH-、H2O2等自由基清除率降低或生成量增加,使晶狀體的上皮細胞和纖維細胞發生凋亡,蛋白質和脂質發生過氧化最終導致白內障的形成[8]。超氧化物歧化酶是晶狀體內抗氧化的關鍵物質,現已證實:糖尿病發生時,當SOD、CAT、GSH-PX活力明顯降低時有大量OH-、O2-和H2O2等活性氧自由基產生,其源自葡萄糖與蛋白質發生糖基化作用后葡萄糖的自氧化過程,因此,有學者認為自由基引起的過度的氧化應激反應是引發糖尿病性白內障的主要原因[9]。TAC衡量的是機體或組織內總的抗氧化能力的大小,SOD是酶促防御系統中的關鍵酶,它既是一種抗氧化劑,又不同于一般的抗氧化劑,它是機體自身產生的一種特殊的抗氧化酶,其作用遠遠大于一般的抗氧化劑,大約是一般抗氧化劑的1000倍以上,對其含量的測定可以反映出機體自身抗氧化能力的大小。MDA是氧化應激反應的一種標志性產物,它是脂質在自由基作用下產生氧化應激反應所生成的產物,且具有細胞毒性,通常用來評價機體氧化應激水平,因此,MDA含量越高說明氧化應激反應就越強。

晶狀體上皮細胞在晶狀體透明性的保護方面有著非比尋常的意義,當晶狀體上皮細胞凋亡達到一定的數量,細胞增生和凋亡失衡導致晶狀體混濁的發生,國內外學者較為一致的觀點是晶狀體上皮細胞的凋亡是年齡相關性白內障、代謝性白內障以及外傷性白內障等形成的細胞學基礎[10]。已有研究顯示,在高血糖的環境下,晶狀體內環境代謝失衡,高糖產生的氧化應激、高滲透壓等損害因子會增加更快,破壞晶狀體的穩定,攻擊晶狀體上皮細胞,破壞晶狀體上皮細胞增生和凋亡的平衡,使晶狀體上皮細胞加速凋亡,最終導致白內障[11]。

中草藥金櫻子(Rosa Laevigata Mickx)屬薔薇科薔薇屬的常綠蔓性灌木,其果實中富含幾十種生理活性物質[12],如維生素、氨基酸、多糖、黃酮類、三萜類等。已有研究發現金櫻子除了可以大幅降低血清膽固醇、甘油三脂和β脂蛋白,還能消炎,保肝護腎,固本培元,止尿及抗衰老,金櫻子中的多糖類和黃酮類化合物能明顯清除肝腎等組織中OH-、O2-等超氧自由基,有明顯的抗氧化和抑制細胞凋亡的作用[13-14]。目前,金櫻子對糖尿病性白內障是否具有防治作用尚無研究報告。

本研究結果證實,在實驗的12周內糖尿病大鼠隨著病情的發展,晶狀體混濁發展的同時晶狀體上皮細胞凋亡率也在相應的增加。然而,經過金櫻子處理后的大鼠,LEC凋亡水平明顯低于糖尿病模型組,說明金櫻子能在一定程度上抑制或延緩了凋亡的發生。

本研究結果發現,糖尿病模型組大鼠與正常對照組比較,一方面晶狀體組織中MDA含量顯著增加,另一方面SOD、TAC活性顯著減弱,經金櫻子處理后的糖尿病大鼠晶狀體組織中MDA含量顯著降低,SOD、TAC活性顯著增強。研究結果表明,金櫻子可以降低晶狀體組織中脂質過氧化產物的生成,提高抗氧化酶的活性和總抗氧化能力,減輕晶狀體的氧化應激反應,起到保護晶狀體維持透明性的作用。本實驗發現,從成模后的第4周開始糖尿病模型組大鼠晶狀體混濁度均顯著高于另外兩組(P＜0.05),經金櫻子處理后的大鼠晶狀體混濁度發展速度則顯著低于糖尿病模型組(P＜0.05)。

綜上所述,本研究從晶狀體的形態學、生物酶學及細胞學三個方面初步研究了金櫻子對糖尿病大鼠晶狀體的保護作用,結果發現金櫻子對糖尿病性白內障大鼠晶狀體上皮細胞凋亡具有一定的抑制功能,并可能與其具有較強的抗氧化能力,最終通過抑制晶狀體組織的氧化應激而實現治療糖尿病性白內障的作用。因此,金櫻子有望成為糖尿病性白內障治療的一種潛在藥物,但其具體的調控機制還有待進一步研究,同時,對于金櫻子中最有效的抗氧化成分的研究還有待深入研究。

[1]Balakumar M,Saravanan N,Prabhu D,et al.Benefits of early glycemic control by insulin on sensory neuropathy and cataract in diabetic rats[J].Indian J Exp Biol,2013,51(1):56-64.

[2]Kim B,Kim SY,Chung SK.Changes in apoptosis factors in lens epithelial cells of cataract patients with diabetes mellitus[J].J Cataract Refract Surg,2012,38(8):1376-1381.

[3]Zhang S,Zheng L,Dong D,et al.Effects of flavonoids from Rosa laevigata Michx fruit against high-fat diet-induced non-alcoholic fatty liver disease in rats[J].Food Chemistry,2013,141(3):2108-2116.

[4]周枉娟,廖前進,張秋菊.金櫻子對糖尿病大鼠腎MCP-1表達的影響[J].現代生物醫學進展,2009,9(23):4425-4427.

[5]Bahmani F,Bathaie SZ,Aldavood SJ,et al.Glycine therapy inhibits the progression of cataract in streptozotocin-induced diabetic rats[J].Mol Vis,2012,18:439-448.

[6]Balakumar M,Saravanan N,Prabhu D,et al.Benefits of early glycemic control by insulin on sensory neuropathy and cataract in diabetic rats[J].Indian J Exp Biol,2013,51(1):56-64.

[7]Katta AV,Katkam RV,Geetha H.Lipid peroxidation and the total antioxidant status in the pathogenesis of age related and diabetic cataracts:a study on the lens and blood[J].J Clin Diagn Res,2013,7(6):978-981.

[8]Li Y,Jia Y,Zhou J,et al.Effect of methionine sulfoxide reductase B1 silencing on high-glucose-induced apoptosis of human lens epithelial cells[J].Life Sci,2013,92(3):193-201.

[9]Li Y,Jia Y,Zhou J,et al.Effect of methionine sulfoxide reductase B1 silencing on high-glucose-induced apoptosis of human lens epithelial cells[J].Life Sci,2013,92(3):193-201.

[10]Kim J,Kim OS,Kim CS,et al.Accumulation of argpyrimidine,a methylglyoxal-derived advanced glycation end product,increasesapoptosis of lens epithelial cells both in vitro and in vivo[J].Exp Mol Med,2012,44(2):167-175.

[11]Kumari SS,Eswaramoorthy S,Mathias RT,et al.Unique and analogous functions of aquaporin 0 for fiber cell architecture and ocular lens transparency.Biochimica et biophysica acta[J].Biochim Biophys Acta,2011,1812(9):1089-1097.

[12]Meng J,Fang Y,Gao J,et al.Phenolics composition and antioxidant activity of wine produced from spine grape(Vitis davidii Foex)and Cherokee rose(Rosa laevigata Michx.)fruits from South China[J].J Food Sci,2012,77(1):C8-14.

[13]Zhang S,Zheng L,Dong D,et al.Effects of flavonoids from Rosa laevigata Michx fruit against high-fat diet-induced non-alcoholic fatty liver disease in rats[J].Food Chemistry,2013,141(3):2108-2116.

[14]Zhang S,Qi Y,Xu Y,et al.Protective effect of flavonoidrich extract from Rosa laevigata Michx on cerebral ischemia-reperfusion injury through suppression of apoptosis and inflammation[J].Neurochem Int,2013,63(5):522-532.