運用實時細胞分析系統監測原代乳鼠心肌細胞的生長及搏動評價抗心律失常藥物

王淑顏，汪溪潔，靳 康，惠濤濤，馬 璟

〔1.中國醫藥工業研究總院上海醫藥工業研究院國家上海新藥安全評價研究中心，上海 201203；2.艾森生物(杭州)有限公司，浙江杭州 310030〕

運用實時細胞分析系統監測原代乳鼠心肌細胞的生長及搏動評價抗心律失常藥物

王淑顏1，汪溪潔1，靳 康2，惠濤濤1，馬 璟1

〔1.中國醫藥工業研究總院上海醫藥工業研究院國家上海新藥安全評價研究中心，上海 201203；2.艾森生物(杭州)有限公司，浙江杭州 310030〕

目的 建立實時細胞分析系統(RTCA)心臟毒性研究方法,并應用于藥物心臟毒性的早期篩選。方法 采用RTCA Cardio系統和新生1～2 d SD大鼠原代培養的心肌細胞建立體外藥物心臟毒性早期篩選方法,并用具有抗心律失常藥物奎尼丁和利多卡因,通過觀察心肌細胞搏動頻率、幅度和搏動節律不規則性(BRI)指數的變化,驗證其評價藥物的心臟毒性的效果。結果 原代心肌細胞接種到RTCA Cardio E-Plate 96孔板24 h后出現心肌細胞搏動,48 h后心肌細胞搏動規律且穩定,可持續至少3 d。加入奎尼丁后迅速抑制心肌細胞的搏動,使心肌細胞的搏動頻率由155±5降到 0,6 h后抑制作用減弱；低濃度奎尼丁(3.1 μmol·L－1)使心肌細胞搏動恢復到124±16。24 h奎尼丁濃度小于100.0 μmol·L－1時,均能全部恢復細胞搏動。利多卡因加入原代心肌細胞后,心肌細胞的搏動頻率、幅度、BRI的變化趨勢呈明顯的濃度依賴性,濃度越高,對心肌細胞的抑制作用越顯著。結論 RTCA Cardio心臟毒性篩選方法可精確地檢測出奎尼丁和利多卡因的心臟毒性,提示RTCA Cardio心臟毒性篩選方法可用于心臟毒性早期篩選。

藥物評價,臨床前；實時系統；奎尼丁；利多卡因；心臟毒性

實時細胞分析Cardio(real-time cell analysis Cardio，RTCA Cardio)是一種基于電子阻抗的非標記、非侵入性、實時的細胞分析監測系統。于2011年推出，可記錄體外培養心肌細胞的搏動頻率、幅度、搏動節律不規則性指數(beating rhythm irregularity，BRI)等指標。奎尼丁和利多卡因是臨床常用且有良效的Ⅰ類抗心律失常藥，但這些藥物均有潛在的致心律失常作用，即引起原有心律失常加重或誘發新的心率失常[1]。本文首先采用1～2 d SD大鼠心肌細胞建立RTCA Cardio心臟毒性研究方法，并通過此方法監測抗心律失常藥物奎尼丁和利多卡因對心肌細胞的生長、瞬時及長時搏動狀態的影響，為以后藥物心臟毒性早期篩選方法的驗證奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

利多卡因，批號:091M0290V，購自美國Sigma公司；奎尼丁，批號:BCBB6721V，購自美國Sigma公司；明膠購自美國Sigma公司；DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、膠原酶Ⅱ、PBS和HBSS均購自美國 Gibco公司；乙醇、二甲亞砜 (dimethyl sulfoxide，DMSO)購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗動物

新生1～2 d SD大鼠10只，SPF級動物，雌雄不限，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，生產許可證號:SXCK(滬)2008-0016。

1.3 主要儀器設備

KK24V45 4℃與－20℃冰箱，德國Siemens公司；WFO-400高壓滅菌鍋，日本Eyela公司；AE100精密天平，美國Mettler Toledo公司；Thermo 815恒溫培養箱、ST16R臺式離心機，美國Thermo Scientific公司；生物安全柜，上海瑞仰凈化設備有限公司；xCELLigence Cardio細胞功能分析儀，美國ACEA Biosciences公司。

1.4 乳大鼠心肌細胞的分離培養

取新生1～2 d的SD大鼠，用75%乙醇消毒。在超凈臺內迅速打開胸腔夾取心臟心尖部，置于預冷的 DMEM中漂洗 3次。將心尖部組織剪成1 mm3碎片，1.5 mL 0.07%胰蛋白酶和0.05%膠原酶Ⅱ消化液37℃恒溫消化12次，棄去上清。向殘留組織塊中加入5 mL含有10%FBS的DMEM培養基吹打3～4次，收集上清800×g離心5 min，棄去上清，用5 mL含有10%FBS的DMEM培養基重懸細胞。將細胞懸液移至培養瓶中進行差速貼壁2次，每次45 min。

1.5 RTCA Cardio系統基線的測定及心肌細胞搏動的監測

向RTCA Cardio E-Plate 96孔板每孔中加入50 μL滅菌后0.1%明膠溶液，置于4℃過夜。移去包被液后，加入50 μL培養基，并將其放在RTCA Cardio工作站上測基線。細胞計數后，將細胞配制成2×109L－1的細胞懸液。向RTCA E-Plate Cardio 96孔板每孔中加入100 μL細胞懸液，使孔中細胞數量達到每孔20 000個，室溫放置30 min后，將其放在RTCA Cardio工作站上監測。每天換液，換液體積120 μL(總體積150 μL)。心肌細胞對溫度的變化較為敏感，溫度變化可使心肌細胞的搏動信號減弱或消失，因此，每次換液都要有部分殘留，且換液過程要快，第2次換液后2 h給藥。用0.1%DMSO作為對照組，奎尼丁、利多卡因分別設計4個濃度組:即3.1，12.5，50.0和200.0 μmol·L－1及12.5，25.0，50.0和100.0 μmol·L－1，每組4個復孔。

1.6 信號采集

數據由RTCA Cardio Software 1.0進行控制和采集，數據采集設置如表1。每次測量時間為20 s，時間分辨率為12.9 ms。獲得數據后，使用RTCA Cardio Software 1.0對心肌細胞的搏動頻率、幅度、BRI進行分析。

Tab.1 Data coIIection setting

1.7 統計學處理

應用SPSS13.0軟件、RTCA Cardio software 1.0、Excel對數據進行統計學分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 原代心肌細胞在RTCA Cardio系統的生長狀態

將分離出的新生1～2 d SD乳鼠的心肌細胞以每孔2×104個接種到RTCA E-Plate Cardio 96孔板上，放在培養箱中的實時細胞分析工作站上培養72 h。由圖1A可知，細胞指數(cell index，CI)值隨著培養時間的延長而增大，12 h時為0.75，24 h時增加到1.5，42 h輕度下降，由第2次更換培養基引起，44 h恢復至2.25，之后持續穩定增長。如圖1B1所示，24 h時觀察到心肌細胞特征性的搏動圖譜，如圖1B2所示，48 h時搏動圖譜均一、穩定，表明心肌細胞在E-Plate Cardio96孔板上生長狀態良好搏動穩定，如圖1B3所示，72 h時心肌細胞的搏動信號減弱。因此，檢測藥物對心肌細胞的作用時最好在72 h內進行。

Fig.1 Growth state of primary cardiomyocytes in reaI-time ceII anaIysis(RTCA)Cardio System.A:the growth curve of primary neonatal rat cardiomyocytes at 72 h after plating.n＝4.B:the transient pulse patterns of the myocardial cells were plated after 24 h(B1)，48 h(B2)and 72 h(B3)，respectively.

2.2 RTCA Cardio系統檢測的奎尼丁對原代心肌細胞搏動頻率、幅度和搏動節律不規則性指數的影響

圖2結果顯示，高濃度奎尼丁(200.0 μmol·L－1)引起心肌細胞生長曲線CI值24 h內顯著性降低；中濃度奎尼丁(50.0和12.5 μmol·L－1)時CI值12 h內顯著性降低；低濃度奎尼丁(3.1 μmol·L－1)時CI值2 h內輕度降低，呈劑量依賴性。給藥前后0.1%DMSO對照組心肌細胞特征性搏動圖譜未發生顯著性變化。

圖3結果顯示，與0.1%DMSO對照組相比，奎尼丁3.1，12.5，50.0和200.0 μmol·L－1均可抑制心肌細胞搏動，0.5～2 h心肌細胞特征性搏動圖譜為直線，心肌細胞搏動信號消失(圖3B2，B3，B4；C2，C3，C4；D2，D3，D4；E2，E3，E4)，6 h后抑制作用減弱，低濃度奎尼丁(3.1 μmol·L－1)心肌細胞特征性搏動圖譜逐漸有所恢復且成一定的劑量-時間依賴性(圖3B2－B8)，24 h時(除200.0 μmol·L－1外)心肌細胞搏動基本全部恢復。

Fig.2 Effect of quinidine on activity of primary neonataI cardiomyocytes.n＝4.

Fig.3 Effect of quinidine on beating of primary neonataI cardiomyocytes.A:0.1%DMSO group；B－E:quinidine 3.1，12.5，50.0 and 200.0 μmol·L－1，respectively.1:0 h time point；2:0.5 h time point；3:1 h time point；4:2 h time point；5:6 h time point；6:12 h time point；7:18 h time point；8:24 h time point.

Fig.4 Effect of quinidine on beat rate(A)，ampIitude (B)and benting rhythm(C)of primary neonataI cardiomyocytes by RTCA Cardio.n＝4.?P＜0.05，compared with 0.1%DMSO.

圖4結果顯示，0.1%DMSO對照組心肌細胞的搏動頻率、幅度、BRI 3項指標在給藥前后未發生顯著性變化。和0.1%DMSO對照組相比，奎尼丁(3.1，12.5，50.0和200.0 μmol·L－1)抑制心肌細胞的上述3項指標，呈明顯的濃度依賴性，濃度越高，對搏動頻率、幅度及節律不規則性指數的抑制作用越顯著，搏動信號恢復需要的時間越長。奎尼丁200.0 μmol·L－1使心肌細胞的搏動頻率、幅度、節律不規則性指數分別由給藥0 h的151±3，0.029± 0.004和(4±1)%降為給藥0.5 h的0，0，0和24 h心肌細胞的搏動頻率、幅度、節律不規則性指數仍分別為0，0和0，心肌細胞未能恢復其搏動，由此可知，奎尼丁200.0 μmol·L－1嚴重損傷心肌細胞，具有明顯的細胞毒性和收縮毒性。奎尼丁12.5 μmol·L－1使心肌細胞搏動頻率、幅度、節律不規則性指數分別由給藥0 h的156±3，0.031±0.002和(4±1)%降為給藥0.5 h的0，0，0和18 h恢復到155±8，0.022± 0.004和(141±18)%，此時心肌細胞的搏動頻率、幅度、節律不規則性指數和對照組97±5，0.035±0.005和(3±0)%相比，搏動幅度明顯降低、搏動頻率和節律不規則性指數顯著升高。奎尼丁3.1 μmol·L－1短時間內(0.5～2 h)抑制心肌細胞搏動，6 h其搏動頻率、幅度、節律不規則性指數分別恢復到125±16，0.025±0.008和(38±24)%。由此可知，和對照組相比，奎尼丁對心肌細胞具有濃度-時間依賴性抑制效應，且濃度過高時可嚴重損傷心肌細胞。

2.3 利多卡因對原代心肌細胞的毒性作用

圖5結果顯示，高濃度利多卡因(100.0 μmol·L－1)和中濃度利多卡因(50.0和25.0 μmol·L－1)作用于心肌細胞后短時間內(1 h)，和對照組0.1%DMSO相比生長曲線CI值明顯下降，且呈濃度依賴性，但隨檢測時間的延長，生長曲線CI值逐漸恢復至正常水平，即短時間內中高濃度利多卡因具有明顯的心肌細胞抑制作用；而低濃度利多卡因(12.5 μmol·L－1)的生長曲線CI值基本未發生變化，即長時間檢測未見利多卡因在該測試濃度范圍內有明顯的心肌細胞抑制作用。

Fig.5 Effect of Iidocaine on activity of primary neonataI cardiomyocytes.n＝4.

圖6結果顯示，給藥前后0.1%DMSO對照組心肌細胞特征性搏動圖譜未發生顯著性變化。和對照組相比，高濃度利多卡因給藥0.5 h心肌細胞特征性搏動圖譜變為直線，心肌細胞搏動信號消失，12 h時心肌細胞搏動逐漸恢復且在24 h時觀察到一定的節律紊亂；中濃度利多卡因給藥0～2 h心肌細胞特征性搏動圖譜為直線，心肌細胞搏動信號消失，6 h逐漸恢復，但仍引起搏動頻率和幅度的降低，24 h時觀察到一定的節律紊亂；低濃度利多卡因給藥24 h內，心肌細胞特征性搏動圖譜基本未發生變化。

Fig.6 Effect of Iidocaine on beating of primary neonataI cardiomyocytes.A:0.1%DMSO group；B，C，D，E: Lidocaine 12.5，25.0，50.0 and 100.0 μmol·L－1，respectively. 1:0 h time point；2:0.5 h time point；3:1 h time point；4:2 h time point；5:6 h time point；6:12 h time point；7:18 h time point；8:24 h time point.

圖7結果顯示，0.1%DMSO對照組心肌細胞的搏動頻率、幅度、節律不規則性指數在給藥前后未發生顯著性變化。和0.1%DMSO對照組相比，利多卡因可抑制心肌細胞的搏動頻率、幅度及節律不規則性指數，呈明顯的濃度-時間依賴性，濃度越高，對搏動頻率、幅度及節律不規則性指數的抑制作用越顯著，搏動信號恢復需要的時間越長且恢復后節律不規則性指數越高。高濃度利多卡因(200 μmol·L－1)給藥0 h時搏動頻率、幅度、節律不規則性指數分別為158±4，0.028±0.006和(4±1)%，給藥0.5 h分別為0，0和 0，給藥 12 h時分別恢復到 84±12，0.035±0.012和(80±8)%；中濃度利多卡因(50 μmol·L－1)給藥0 h時搏動頻率、幅度、節律不規則性指數分別為167±19，0.030±0.008和(4± 1)%，給藥0.5 h分別降為0，0和0，給藥6 h時分別恢復到162±65，0.027±0.014和(18±3)%；而低濃度利多卡因(12.5 μmol·L－1)給藥0 h時搏動頻率、幅度、節律不規則性指數分別為159±4，0.029± 0.005和(4±1)%，給藥 0.5 h分別為 152±21，0.030±0.010和(12±4)%，給藥6 h分別為118±7，0.035±0.009和(4±1)%，給藥12 h分別為92±5，0.017±0.005和(29±7)%，和對照組相比無顯著性差異。

Fig.7 Effect of Iidocaine on beating rate(A)，ampIitude(B)and beating rhythm irreguIarity(C)of primary neonataI cardiomyocytes by RTCA Cardio.s，n＝4.?P＜0.05，compared with 0.1%DMSO.

3 討論

在本研究中，我們提出了一個以原代培養的乳鼠心肌細胞為基礎，運用RTCA Cardio系統監測記錄心肌細胞生長和搏動狀態的方法。RTCA Cardio系統具有高的時間分辨率(12.9 ms)，通過瞬時和長時間監測記錄給藥后心肌細胞搏動狀態變化引起的阻抗信號的改變對藥物進行評價。將心肌細胞接種到底部含有金屬電極的RTCA Cardio E-Plate 96孔檢測板上，細胞與檢測板底部金屬電極相互作用引起阻抗的變化，阻抗主要是由點及周邊離子環境所決定[2－3]。當心肌收縮和舒張時引起阻抗變化，將阻抗變化換算成CI值，CI值能反映細胞生長、形態變化、貼壁程度以及死亡等一系列生理狀態，通過CI值的變化分析出心肌細胞搏動頻率、節律幅度變化，即在近似生理環境下實時、無標記、非侵入性動態地監測心肌細胞搏動頻率、幅度、搏動節律不規則指數等指標的變化對藥物進行評價[4]。這些指標既可以評價離子通道藥物引起的心肌細胞生長和搏動狀態的變化，也可以評價非離子通道藥物引起的心肌細胞生長和搏動狀態的變化。且該系統可以進行實時記錄分析，呈現出心肌細胞特征性的搏動圖譜，這些圖譜的變化可簡便直觀實時觀察到心肌細胞的搏動狀態，操作相對簡單、通量大、靈敏度高。在此實驗中，接種密度為每孔20 000個，濃度過高或過低均會影響到心肌細胞搏動的規律性和穩定性。因此，在鋪板時可以根據個人的計數習慣設置合適的密度。原代培養的心肌細胞對溫度變化非常敏感，在換液時速度要快(7～10 min)，更換培養基時需部分殘留(1/5)，否則將引起心肌細胞搏動信號的減弱或消失。

RTCA Cardio系統可以對影響心臟功能的多靶向藥物作用進行整合評價，能夠靈敏、定量地檢測藥物對參與心肌細胞生長和搏動功能的主要離子通道的作用，尤其是鈉、鉀、鈣離子通道。奎尼丁臨床上主要用于治療房顫、房撲的復律治療及復律后維持竇律，室上性及室性心動過速[5－6]，是一種非選擇性Na＋通道抑制劑，屬于Ⅰa類抗心律失常藥物，可抑制0相、4相Na＋內流和3相K＋外流(中度阻斷鈉內流，輕度抑制鉀外流)，高濃度奎尼丁可抑制Ca2＋內流，降低細胞的自律性，對浦肯野細胞作用最強。通過RTCA Cardio系統監測到在給予奎尼丁(3.1，12.5，50.0和200.0 μmol·L－1)后10 min引起心肌細胞搏動消失，6 h開始逐漸恢復，18 h后除最高濃度外基本全部恢復，低濃度奎尼丁(12.5 μmol·L－1)在18～24 h內觀察到明顯的心律失常，此觀察結果與奎尼丁促進不良電生理的發生使房室傳導加快，誘發室性快速性心律失常的報道相一致[7－8]。在本次實驗中設計的濃度有所偏高，在4個濃度范圍內Ca2＋內流被抑制，導致初始階段所有濃度心肌細胞搏動消失，但隨培養時間延長，可呈現一定程度的恢復，具有一定的濃度依賴性關系；在作用后期階段(18 h后)，心肌細胞搏動恢復后搏動頻率有較顯著的提高，并且部分濃度會出現陣發性快速搏動。該作用與藥物臨床上引起心動過緩、停博和陣發性心動過速的作用較為接近[9－11]。RTCA Cardio系統整合性地分析評價影響心臟功能的藥物對心肌細胞生長和搏動狀態的影響，從影響心肌細胞搏動狀態變化的角度去評價藥物，有效地降低了單離子通道體外檢測方法、非離子通道單個指標評價方法產生的假陰性率。

同樣，利多卡因也是一種Na＋通道抑制劑，同時還具有K＋通道活化作用[12]，屬于ⅠB類抗心律失常藥，臨床作為終止室速室顫的主要藥物被廣泛應用。它通過抑制Na＋電流，抑制心肌細胞舒張期除極，降低心室肌及心肌傳導纖維的自律性及興奮性。RTCA Cardio系統顯示給予高濃度利多卡因(200.0 μmol·L－1)0.5 h后，迅速引起心肌細胞搏動消失，且在12 h后出現明顯的心率失常。此評價結果與利多卡因引起急性心肌梗死率，缺血再灌注心室壁復極離散度增加[13]以及誘發潛在的惡性心律失常的報道相似[14]。利多卡因抑制Na＋通道的開放，導致心肌細胞動作電位受到抑制，在給藥后短時間內引起心肌細胞搏動頻率、幅度降低且呈劑量依賴性。RTCA Cardio系統長時間未觀察到利多卡因在測試濃度范圍內明顯的細胞毒性作用，但高濃度利多卡因(200.0 μmol·L－1)除外，它具有較明顯的心臟毒性作用，且在給藥后12 h產生一定的心律失常，而其他濃度僅有一定的降低搏動頻率的作用，說明利多卡因可以降低心肌細胞的自律性和興奮性，存在一定的濃度依賴性，與Goineau等[15]報道一致。由此可見RTCA Cardio系統可以通過統計心肌細胞搏動頻率、幅度、搏動節律不規則性的變化，靈敏地、定量地檢測出藥物對心肌細胞的作用。

綜上所述，聯合利用實時RTCA Cardio系統和乳鼠原代心肌細胞建立的臨床前藥物心臟毒性評價方法，可以在早期對先導化合物的臨床前心臟毒性進行篩選，因為它的時間分辨率，心肌細胞機械搏動活動的動態監控，以及96孔板的通量，都將提供非常有價值的關于先導化合物對心臟毒性作用的信息。目前國外幾個大型制藥公司已開始使用此技術進行藥物和候選化合物早期的心臟毒性篩選研究。FDA在2012年10月也購買了RTCA Cardio系統，說明該方法在制藥領域越來越被認可。

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A reaI-time ceII anaIysis system for evaIuating anti-arrhythmic drugs by monitoring the growth and beating of primary neonataI rat cardiomyocytes

WANG Shu-yan1，WANG Xi-jie1，JIN Kang2，HUI Tao-tao1，MA Jing1
〔1.Shanghai Institute of pharmaceutical Industry，National Shanghai Center for New Drug Safety Evaluation＆Research，State Institute of Pharmaceutical Industry，Shanghai201203，China；2.ACEA BIO(Hangzhou)Co.，LTD，Hangzhou310030，China〕

OBJECTIVE To establish a real-time cell analysis system(RTCA)for early drug cardiotoxicity evaluation.METHODS An in vitro drug cardiotoxicity evaluation method was established using RTCA Cardio system and primary cultured cardiomyocytes of neonatal rats.The beating rate，amplitude and beating rhythm irregularity(BRI)of cardiomyocytes were observered after antiarrhythmic drugs，such as quinidine and lidocaine were added，to assess the effect of the above method on cardiotoxicity evaluation.RESULTS RTCA Cardo E-Plate 96 was inoculated with primary cultured cardiomyocytes that began to beat after 24 h and beat regularly after 48 h.The stable beating was maintained for a minimum of three days.The beating of cardiomyocytes decreased rapidly from 155±5 to 0 after incubation with quinidine.The beating recovered gradually after 6 h.Quinidine at 3.1 μmol·L－1caused the beating rate to return to 124±16.Quinidine allowed the beating rate to return to normal when the concentration was less than 100.0 μmol·L－1.The beating rate，amplitude and BRI of cardiomyocytes changed in a concentration-dependent manner when incubating with lidocaine.The higher the concentration，the more significant the inhibition of lidocaine on cardiomyocytes.CONCLUSION The cardiotoxicity of quinidine and lidocaine can be detected accurately using RTCA Cardio system，suggesting that this system can be used in early evaluation of drug cardiotoxicity.

drug evaluation，preclinical；real-time systems；lidocaine；quinidine；cardiotoxicity

MA Jing，Tel:(021)50801763，E-mail:jma＠ncdser.com

R965.1

:A

:1000-3002(2014)06-0837-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2014.06.004

Foundation item:The project supported by National Science and Technology Major Project of China(2012ZX09302002)

2013-11-18 接受日期:2014-08-21)

(本文編輯:喬 虹)

國家“重大新藥創制”科技重大專項(2012ZX09302002)

王淑顏，女，碩士研究生，主要研究方向心臟毒理 學，E-mail:wangshuyan368＠ 163.com，Tel: 13918849591

馬 璟，Tel:(021)50801763，E-mail: jma＠ncdser.com