吳茱萸堿對人結腸癌細胞周期阻滯及凋亡的影響

趙綠翠，張景勍，游智梅，李科瓊，羅 念，李 靜

(重慶醫科大學1.組織學與胚胎學教研室干細胞與組織工程實驗室，2.藥物高校工程研究中心，重慶 400016)

吳茱萸堿對人結腸癌細胞周期阻滯及凋亡的影響

趙綠翠2，張景勍2，游智梅1，李科瓊1，羅 念1，李 靜1

(重慶醫科大學1.組織學與胚胎學教研室干細胞與組織工程實驗室，2.藥物高校工程研究中心，重慶 400016)

目的 探討吳茱萸堿對人結腸癌細胞周期阻滯及凋亡的影響及其作用機制。方法 體外培養人結腸癌HCT-116細胞分別加入吳茱萸堿1.5,3.0,6.0和12 μmol·L－1繼續培養24,48和72 h,CCK-8法檢測吳茱萸堿對HCT-116細胞存活的影響；用流式細胞術檢測吳茱萸堿對HCT-116細胞凋亡和細胞周期的影響；倒置顯微鏡鏡下觀察細胞形態變化；熒光顯微鏡觀察 Hoechst染色后細胞凋亡的形態學改變；Western蛋白質印跡法檢測細胞周期蛋白A1的表達及凋亡相關蛋白P53,Bax,Bcl-2,激活型胱天蛋白酶3的表達。結果 吳茱萸堿1.5,3.0和6.0 μmol·L－1作用24,48和72 h后,HCT-116細胞增殖受到抑制(P＜0.05),且呈時間(r時間＝0.744,P＜0.05)和濃度(r濃度＝0.953,P＜0.01)依賴性。吳茱萸堿作用HCT-116細胞48 h后,S期細胞由正常對照組的(13.9±7.0)%增加至(39.7±11.7)%(P＜0.05)；細胞凋亡率由正常對照組的(4.2±3.0)%增加至(14.9±5.8)%(P＜0.05)。光學顯微鏡下可見,隨著藥物濃度的增加,細胞的形態發生改變,胞膜破裂,產生細胞碎片,并出現大量漂浮細胞；Hoechst染色可見部分細胞出現細胞核固縮、核發白、染色質凝集等凋亡變化；P53、Bax和激活型胱天蛋白酶3蛋白表達增加,Bcl-2、細胞周期蛋白A1蛋白表達下降。結論 吳茱萸堿能夠通過下調細胞周期蛋白A1的表達；激活P53信號通路,下調Bcl-2、上調Bax,破壞Bcl-2/Bax的比例；激活胱天蛋白酶3,共同促進人結腸癌HCT-116細胞的凋亡。

吳茱萸堿；HCT-116細胞；細胞凋亡；細胞周期；細胞周期蛋白A1；胱天蛋白酶3

人結腸癌是一種常見的胃腸道惡性腫瘤，其發病率居全球常見惡性腫瘤的第3位，每年新增患者＞100萬人，其死亡率＞30%[1－2]。對于早期患者，臨床治療主要以手術為主，但對于晚期和復發患者，大多只能依靠放療或化療的方式進行治療。結腸癌化療一般采用聯合化療，利用不同的化療藥，對腫瘤細胞的打擊面增寬，可以減少耐藥的發生。但是化療藥物本身存在極大的毒副作用，導致患者因承受不了化療的痛苦而放棄治療甚至因化療致死。因而，尋找低毒高效的抗結腸癌中藥，提高患者的生活質量成為當下研究的熱點。

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸〔Evodia rutaecarpa (Juss.)Benth.〕，石虎〔E.rutaecarpa(Juss.) Benth.var.officinalis(Dode)Huang〕或梳毛吳茱萸〔Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.Var.bodinieri (Dode)Huang〕的干燥近成熟果實。主產于長江流域、陜西及華南等地。始載于《神農本草經》，味辛、苦，性熱；具有散寒止痛，降逆止嘔，助陽止瀉之功。常用于治療肝胃虛寒、陰濁上逆所致的頭痛或胃脘疼痛等癥。吳茱萸堿(evodiamine)是其有效成分。近年來的研究表明，吳茱萸堿對多種腫瘤細胞，如人宮頸癌HeLa細胞[3]、人前列腺癌pc-3細胞[4]、人肝癌HepG2細胞[5]、人急性白血病CCRFCEM細胞[6]和小鼠纖維肉瘤L929細胞[7]、人胃癌SGC-7901細胞[8]及人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞[9]等具有明顯的抑制作用，但未見其對人結腸癌HCT-116細胞作用與機制的相關報道。本文以人結腸癌細胞HCT-116為研究對象，觀察吳茱萸堿對細胞存活和凋亡的影響，并初步探討其誘導細胞凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

吳茱萸堿標準品購自中國南京澤朗醫藥公司，批號為ZL20131015，HPLC檢測純度≥98%，規格為50 mg/支。用二甲亞砜(DMSO)溶解，儲存濃度為100 μmol·L－1，實驗時用完全培養基稀釋成所需濃度(DMSO終體積分數不超過0.001)。高糖DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁研究所；AnnexinⅤ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、Hoechst染色試劑盒、兔抗人胱天蛋白酶3單克隆抗體均購自碧云天生物技術研究所；P53、Bax、Bcl-2抗體購于美國Abcam公司；兔抗人細胞周期蛋白A1多克隆抗體購于美國Immunoway公司；β肌動蛋白抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG購于美國Cell Signaling Technology公司；ECL發光液購自美國Millipore公司；其余試劑均為國產分析純。CO2恒溫培養箱，美國Thermo Scientific公司；超低溫冰箱，美國Revco公司；高速臺式離心機，美國Sigma公司；倒置熒光顯微鏡，日本Nikon公司；純水儀，美國Millipore公司；FACScan流式細胞儀，美國 Becton Dickinson公司；M450酶標儀，PAC3000型電泳儀、電轉儀，美國Bio-Rad公司。

1.2 細胞來源及培養

人結腸癌HCT-116細胞株由第三軍醫大學基礎醫學部遺傳教研室惠贈。用含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養基，于37℃，5%CO2及飽和濕度條件下常規培養，每2～3 d傳代1次，所有實驗均在細胞對數生長期進行。

1.3 CCK-8法檢測細胞存活抑制率

取處于對數生長期的人結腸癌細胞HCT-116，調整細胞密度為1×108L－1，以每孔100 μL的細胞懸液接種于96孔板，培養過夜貼壁后棄去培養上清液，加入吳茱萸堿，使其終濃度為1.5，3.0，6.0和12.0 μmol·L－1，每孔200 μL，每個藥物組作3個復孔，各藥物作用組作為實驗組。空白組為含0.1% DMSO的200 μL完全培養基，對照組為含與實驗組等量細胞的200 μL細胞懸液。細胞培養24，48和72 h后，每孔加入20 μL的CCK-8試劑并放孵箱孵育3 h，酶標儀于450 nm波長處測定各孔的吸光度(A450nm值)，細胞存活抑制率由下面公式計算:

細胞存活抑制率%＝〔1－(實驗 A－空白A)/ (對照A－空白A)〕×100%

1.4 流式細胞儀檢測細胞周期

取對數生長期的人結腸癌HCT-116細胞，以2×108L－1的密度接種于6孔板，分別設置對照組和藥物組，每組平行3個復孔。培養24 h后藥物組加入終濃度為1.5，3.0和6.0 μmol·L－1的吳茱萸堿處理48 h，棄上清并以PBS液洗滌1次，收集細胞，70%冰乙醇重懸，4℃固定過夜。離心后棄去固定液，用適量PBS重懸，加入RNA酶工作液和碘化丙啶，4℃避光染色30 min，過濾網后，進行常規光路校準，流式細胞儀檢測，經計算軟件分析得到細胞周期各時相比例。

1.5 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡

取對數生長期的人結腸癌HCT-116細胞，以2×108L－1的密度接種于6孔板，分別設置對照組和藥物組，每組平行3個復孔。培養24 h后藥物組分別加入終濃度為1.5，3.0和6.0 μmol·L－1的吳茱萸堿處理48 h，收集上清并以PBS液洗滌1次，收集全細胞，按照AnnexinⅤ-FITC/PI雙染細胞檢測試劑盒說明書操作，流式細胞儀檢測分析。

1.6 Hoechst染色檢測細胞核的形態變化

取無菌的防脫蓋玻片置于6孔板內，以2×108L－1的密度接種于6孔板。分別設置對照組和藥物組，每組平行3個復孔。培養24 h后藥物組加入終濃度為1.5，3.0和 6.0 μmol·L－1的吳茱萸堿處理48 h，吸盡舊培養液，每孔加入1 mL固定液，固定30 min。去除固定液，用PBS洗2次，每次3 min。吸盡液體，加入1 mL Hoechst33258染色液，染色5 min。棄去染色液，用PBS洗2遍，每次3 min。滴1～2滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，讓細胞面接觸封片液，盡量避免氣泡產生。使用熒光顯微鏡觀察，激發波長為350 nm左右，發射波長460 nm左右。隨機選取3個視野，觀察細胞核染色并拍照。

1.7 倒置光學顯微鏡觀察細胞形態變化

取對數生長期的人結腸癌HCT-116細胞，以2×108L－1的密度接種于6孔板中，培養24 h后棄去上清，分別加入含終濃度為1.5，3.0和6.0 μmol·L－1的吳茱萸堿的完全培養基作用48 h，光學顯微鏡下觀察并隨機選取≥3個視野進行拍照。

1.8 Western蛋白質印跡檢測細胞周期蛋白A1、P53、Bax、BcI-2和激活型胱天蛋白酶3蛋白的表達

取處于對數生長期的人結直腸癌HCT-116細胞以5×108L－1的密度接種于10 cm的培養皿中，分別設置對照組和藥物組，常規培養24 h后藥物組分別加入終濃度為1.5，3.0和6.0 μmol·L－1的吳茱萸堿誘導48 h，用細胞裂解液于冰上同時裂解各組細胞30 min，16 000×g，離心10 min，提取各組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白含量。運用酶標儀測定各組蛋白質含量并配平，使各組蛋白終濃度一致。每個點樣孔加樣40 μg蛋白樣品液，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質。凝膠上的蛋白轉到0.45 μm的PVDF膜，5%的脫脂牛奶封閉膜上的蛋白結合位點2 h。采用兔抗人細胞周期蛋白A1(1∶500)、P53 (1∶1000)、Bax(1∶1000)、Bcl-2(1∶1000)、激活型胱天蛋白酶3(1∶1000)，兔抗人內參β肌動蛋白多抗(1∶1000)，4℃孵育過夜。用TBST溶液漂洗3次，每次10 min。分別加入辣根過氧化物標記的山羊抗兔IgG(1∶1000)常溫孵育1.5 h。TBST溶液漂洗，用ECL試劑發光，曝光。圖像掃描后運用圖像分析軟件Quantity One分析條帶的吸光度值，將對照組和藥物組的目的條帶的積分吸光度值和內參的積分吸光度值比值表示蛋白質相對表達水平。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 吳茱萸堿對人結腸癌HCT-116細胞存活抑制率的影響

CCK-8結果(圖1)顯示，吳茱萸堿1.5，3.0，6.0和12.0 μmol·L－1分別作用HCT-116細胞48 h后，HCT-116細胞表現出明顯的增殖抑制作用，且隨著吳茱萸堿濃度的增加和作用時間的延長，其抑制作用逐漸增強，呈時間和濃度依賴性。與正常對照組相比，吳茱萸堿1.5，3.0，6.0和12.0 μmol·L－1對HCT-116細胞存活抑制率顯著增加，分別為(0.21±0.06)%，(0.27±0.03)%，(0.51±0.02)%和(0.58±0.02)%(P＜0.01)。此外，吳茱萸堿12 μmol·L－1表現出一定程度的細胞毒性。吳茱萸堿與HCT-116細胞作用24，48和72 h的IC50值分別為8.24±0.72，7.50±0.47和(5.13±1.10)μmol·L－1。

Fig.1 Effect of evodiamine on proIiferation of HCT-116 ceIIs.n＝3.

2.2 吳茱萸堿對人結腸癌HCT-116細胞周期的影響

流式細胞儀檢測(圖2，表1)結果顯示，與正常對照組比較，吳茱萸堿1.5，3.0和6.0 μmol·L－1誘導HCT-116細胞48 h后，各時相的細胞比例發生了不同程度的變化。藥物組的G0/G1期的細胞比例由正常對照組的(77.4±5.7)%下降至(18.4±8.3)%(P＜0.01)；S期的細胞比例由正常對照組的(13.9±7.0)%增加至(39.7±11.7)%(P＜0.05)；G2/M期的細胞比例由正常對照組的(10.0±1.3)%增加至(41.9±19.8)%(P＜0.01)，細胞周期被阻滯在S期和G2/M。

Tab.1 Effect of evodiamine on ceII cycIe of HCT-116 ceIIs

2.3 吳茱萸堿對人結腸癌HCT-116細胞凋亡的影響

2.3.1 流式儀檢測

吳茱萸堿1.5，3.0和6.0 μmol·L－1作用HCT-116細胞 48 h后，HCT-116細胞的凋亡率分別為(7.3±1.2)%，(13.0±4.0)%和(14.9±5.8)%，隨著藥物濃度的增加，HCT-116細胞的凋亡率逐漸增高，與正常對照組的(4.2±3.0)%比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。

Fig.3 Effect of evodiamine on apoptosis of HCT-116 ceIIs detected by fIow cytometry.A:normal control；B－D: evodiamine 1.5，3.0 and 6.0 μmol·L－1for 48 h，respectively.

2.3.2 Hoechst染色

圖4結果顯示，正常對照組的HCT-116細胞發出均勻的淡藍色熒光，細胞核無明顯的凋亡形態學變化(圖4A)；吳茱萸堿1.5，3.0和6.0 μmol·L－1分別作用48 h后，隨著藥物濃度的增加，細胞核出現不同程度的核染色質濃縮聚集，核碎裂，核邊集，并發出較強的藍白色熒光，表現出細胞凋亡的典型病理變化(圖4B～D)。

Fig.4 Effect of evodiamine on morphoIogy of HCT-116 ceII nucIeus.A:normal control of HCT-116 cells；B－D:evodiamine 1.5，3.0 and 6.0 μmol·L－1for 48 h，respectively.Arrows show pathologic changes in apoptosis.

2.4 吳茱萸堿對人結腸癌HCT-116細胞形態的影響

如圖5，正常對照組細胞生長良好，細胞輪廓清晰規則，呈多邊形，細胞間相互邊接成片生長(圖5A)；吳茱萸堿1.5，3.0和6.0 μmol·L－1分別作用HCT-116細胞48 h后，隨著藥物濃度的增加，細胞數目顯著減少，細胞皺縮變圓變小(圖5B～D)，碎裂，細胞畸形，出現大量漂浮細胞。

Fig.5 Effect of evodiamine on morphoIogy of HCT-116 ceIIs by opticaI microscopy.A:normal control；B－D:evodiamine 1.5，3.0 and 6.0 μmol·L－1for 48 h，respectively.Arrows show morphological changes in apoptosis.

2.5 吳茱萸堿對人結腸癌HCT-116細胞周期蛋白A1、P53信號通路及激活型胱天蛋白酶3蛋白的影響

Western印跡檢測結果顯示，吳茱萸堿1.5，3.0和6.0 μmol·L－1分別作用于HCT-116細胞48 h后，與正常對照組比較(圖6)，P53抑癌蛋白、凋亡促進蛋白Bax和激活型胱天蛋白酶3蛋白的表達上調；凋亡抑制蛋白Bcl-2和細胞周期蛋白A1的表達下調，與正常對照組之間的對比均有顯著性差異(P＜0.05)。這一結果表明，在吳茱萸堿誘導HCT-116細胞凋亡的過程中，可能存在細胞周期蛋白A1的下調、P53信號和胱天蛋白酶3激活的共同參與。

Fig.6 Effect of evodiamine on cycIinA1(B)，P53(C)，Bax(D)，BcI-2(E)，cIeaved caspase-3(F)protein expression of HCT-116 ceIIs detected by Western bIotting.B－F were the semiquantitative results of A.Lane 1: normal control；lanes 2－4:evodiamine 1.5，3.0 and 6.0 μmo·lL－1for 48 h，respectivelyn＝3.?P＜0.05，??P＜0.01，compared with evodiamine 0 μmol·L－1group.

3 討論

本研究結果表明，吳茱萸堿對人結腸癌HCT-116細胞也有較強的殺傷作用，能有效抑制HCT-116細胞的增殖。流式細胞儀檢測結果顯示，吳茱萸堿對HCT-116細胞周期的分布有顯著的影響，可使HCT-116細胞周期阻滯在S期和G2/M期，從而影響細胞周期的正常運行。細胞周期蛋白A1是細胞周期的一種正性調節因子，參與細胞S期和G2/M期的周期調節，是人類細胞周期蛋白家族中的一個主要成員。細胞周期蛋白在腫瘤的發生、發展過程中可與癌基因產物協同產生抗癌作用。周期蛋白A1在細胞周期進程中，分別與CDK1和CDK2結合，以復合物的形式作用于2個檢查點G1/S期和G2/M期的轉換，具有調節DNA合成和促進細胞有絲分裂的雙重作用。有關研究報道，細胞周期蛋白A1參與P53信號通路激活所致的細胞凋亡和增殖阻滯作用[10]。

Western印跡檢測結果顯示，吳茱萸堿引起細胞周期阻滯時伴隨著細胞周期蛋白A1的下調。提示吳茱萸堿可能通過抑制HCT-116細胞周期蛋白A1蛋白的表達引起細胞的S期和G2/M期阻滯進而抑制細胞的增殖。

Hoechst染色發現，吳茱萸堿能使HCT-116細胞核染色質濃縮聚集，核碎裂，并發出較強的藍白色熒光等細胞凋亡特征。且AnnexinⅤ/PI雙染色法檢測結果也證實，隨著藥物濃度的增加，HCT-116細胞的凋亡率逐漸增高。綜上，吳茱萸堿可誘導HCT-116細胞凋亡，阻止腫瘤惡化。

p53(mtp53)基因是一種抑癌基因，是迄今為止與人類惡性腫瘤相關性最高的腫瘤抑制基因，該基因位于人第17對染色體的短臂上[11]，P53信號通路為癌癥發生中的一個關鍵信號通路。p53基因可以通過參與誘導細胞周期阻滯、促進細胞凋亡和DNA的修復等，發揮避免受損DNA堆積、維持基因組的穩定及調節細胞的分化與衰老等功能活動。研究發現，許多天然抗腫瘤藥物可以通過上調腫瘤細胞內p53基因的表達從而實現抗腫瘤作用[12－14]。本研究發現，吳茱萸堿誘導細胞凋亡時伴隨著P53蛋白的上調。吳茱萸堿可能通過激活P53通路來啟動細胞凋亡途徑，從而引起凋亡的發生。另外，P53信號通路中的Bcl-2和Bax間的比例決定該細胞是否接受凋亡發生的信號[15]。Bcl-2家族成員與細胞凋亡密切相關，Bcl-2蛋白在一些腫瘤細胞如白血病中呈過度表達；其在細胞中的定位已經證實，在不同類型的細胞中可以定位于核膜、內質網及線粒體上，并通過阻止線粒體細胞色素c的釋放而發揮抗凋亡作用；Bax是Bcl-2家族中參與細胞凋亡的一個重要成員，當細胞受到外界干擾或刺激而發生凋亡時，它從胞質遷移至線粒體和核膜，導致包括細胞色素c在內的多種促凋亡蛋白的釋放，并激活胱天蛋白酶家族，產生胱天蛋白酶級聯反應執行細胞凋亡；而胱天蛋白酶3是細胞凋亡過程中最關鍵的執行分子之一，可以剪切細胞凋亡過程中的許多關鍵蛋白。Western印跡檢測結果顯示，吳茱萸堿能有效抑制Bcl-2蛋白的表達，增加促凋亡蛋白Bax的表達，即Bcl-2和Bax間的比例被破壞，同時激活胱天蛋白酶3，共同促進細胞凋亡的發生。

本研究發現，吳茱萸堿誘導HCT-116細胞凋亡有可能通過下調細胞周期蛋白A1的表達，同時激活P53信號通路和胱天蛋白酶3共同實現。

綜上所述，吳茱萸堿對人結腸癌HCT-116細胞有明顯的抗癌活性，且起效濃度低，因而為臨床腫瘤的治療開發一種低毒高效的抗腫瘤藥物或藥物前體提供了一定的參考價值，是一種開發前景廣闊的天然藥物。但關于吳茱萸堿具體作用位點和詳細作用機制，以及其毒性作用以及藥動學特性等均不明確，還有待進一步的研究。

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Effect of evodiamine on apoptosis and ceII cycIe arrest in human coIorectaI cancer ceIIs

ZHAO Lyu-cui2，ZHANG Jing-qing2，YOU Zhi-mei1，LI Ke-qiong1，LUO Nian1，LI Jing1
(1.Laboratory of Stem Cell and Tissue Engineering，Department of History and Embryology，Chongqing Medical University，2.Drug Engineering Research Center of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China)

OBJECTIVE To investigate the effect of evodiamine on proliferation of human colorectal cancer cells and to explore its mechanism of apoptosis in human colorectal cancer cells.METHODS Human colorectal cancer cell lines(HCT-116)were cultured with evodiamine at the concentrations of 1.5，3.0 and 6.0 μmol·L－1for 24，48 and 72 h，respectively.The proliferation of cells was detected by CCK-8，the cell cycle and apoptosis of cells treated were measured by flow cytometry，changes in cell morphology were observed under an inverted microscope and morphological changes in apoptotic cells were observed under a fluorescence microscope after Hoehst staining.The protein expression of P53，Bax，Bcl-2，cleaved caspase 3 and cyclin A1 was examined by Western blot.RESULTS The proliferation of cells was significantly inhibited by evodiamine in a time and concentration-dependent manner(rTime＝0.744，P＝0.05；rConcentration＝0.953，P＜0.01).The percentage of cells in S phase increased from(13.9± 7.0)%to(39.7±11.7)%(P＜0.05)and the rate of apoptosis cells up-regulated from(4.2±3.0)%to (14.9±5.8)%(P＜0.05)when HCT-116 cells were treated with different concentrations of evodiamine for 48 h.Plasmatorrhexis and distortion occurred in a concentration-dependent manner while a large amount of cell debris and a large number of floating cells were observed under the microscope.Hoechst staining indicated cell shinkage，nuclear condensation and appare pale.The expression of P53，Bax and cleaved caspase 3 was obviously increased while the Bcl-2 and cyclin A1 significantly decreased.CONCLUSION Evodiamine can induce the apoptosis of human colorectal cancer cells mainly by down-regulating the expression of cyclin A1 and activation of P53 signal pathway，breaking the balance of Bcl-2/Bax，and ultimately activating caspase 3.

evodiamine；HCT-116 cells；apoptosis；cell cycle；cyclin A1；caspase 3

LI Jing，Tel:13370762980，E-mail:lijingyangyang＠126.com

R285，R966

:A

:1000-3002(2014)06-0863-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2014.06.008

Foundation item:The project supported by National Natural Science Foundation of China(31271368)；and by Chongqing Municipal Education Commission Foundation Project(KJ130312)

2014-06-24 接受日期:2014-09-30)

(本文編輯:喬 虹)

國家自然科學基金項目(31271368)；重慶市教委基金項目(KJ130312)

趙綠翠，女，碩士研究生，主要從事中藥及其有效成分抗腫瘤分子細胞藥理學的研究。

李 靜，E-mail:lijingyangyang＠126.com，Tel:13370762980