酶體外定向進化技術及其發展

程夢婷

摘 要：酶體外定向進化技術可以大幅度提高酶分子的進化效率，可以在未知酶空間結構和催化機制下，按照人們的期望實現特定目標化。酶體外定向進化技術對酶工程今后的發展非常重要，對酶體外定向進化技術的研究方法和發展前景做了歸納。

關鍵詞：酶；定向進化；蛋白質工程；發展前景

中圖分類號：Q55 文獻標識碼：A 文章編號：2095-6835（2014）02-0001-02

酶的定向進化是20世紀90年代初興起的一種蛋白質工程的新策略，近年來發展迅速。酶能催化各種各樣的化學反應，可使需要幾天幾個月甚至幾年時間完成的轉化在幾分鐘甚至幾秒鐘內完成，能催化化學方法難以完成的反應，如構象的改變等。同時，它無毒無害，對環境沒有污染，在環境問題日益嚴重的今天，酶的應用顯得至關重要。

1 概述

酶的體外定向進化又稱蛋白質分子定向進化，是蛋白質工程的新策略。簡單來說，就是在事先不了解酶的空間結構和催化機制的情況下，在實驗室中通過模擬達爾文自然進化過程，讓目標酶分子在預先設計好的道路上快速進化，獲得有價值的非天然酶。

定向進化是隨機突變和選擇的結合，隨機突變是人為控制某些條件改變而引發的。后者雖相當于環境，但只作用于突變后的分子群，起選擇預期方向的突變、排除其他方向突變的作用，整個進化過程是在人為控制下進行的。

定向突變使在自然選擇條件下需幾百萬年乃至上億年才能完成的進化過程，縮短到幾年、幾個月，甚至更短的時間，加速了酶的進化過程。目前，該方法主要應用于提高酶的穩定性、酶活性、對有機溶劑的耐受性，擴大底物的選擇性，改變光學異構體的選擇性等方面。

在目前已發現的8 000多種酶中，真正能夠進行大規模生產和應用的商品酶并不多，主要原因是天然酶的性質與工業生產環境，例如高溫、高壓、有機溶劑、極端pH等的要求相差甚遠。天然酶的底物選擇性等性質難以滿足工業對蛋白酶的需求。酶的定向進化技術是酶工程學研究的有效工具，該技術的發展使酶應用于工業生產成為可能。

2 酶體外定向進化的常用方法

2.1 易錯（error-prone）PCR

易錯PCR技術是指采用Taq酶進行PCR擴增目的基因時，通過調整反應條件，比如提高鎂離子濃度、加入錳離子等方式改變體系中4種dNTP的濃度等，改變Taq酶的突變頻率，從而向目的基因中引入隨機突變構建出突變體庫，并從中選擇或篩選出所需要的突變體。由于在實驗中僅經過一次易錯PCR擴增，所以往往很難得到所需的突變，由此而產生了連續易錯PCR擴增技術，即一次PCR獲得的擴增基因作為下一次的目的基因進行操作，連續多次進行上述PCR過程，直至獲得突變顯著的結果基因。

易錯PCR是一種相對簡單、快速、低廉的方法，但該方法較為費時、費力，一般適用于較小的基因片段（<800 bp）。

目前，使用易錯PCR的方法已取得了一定的成果。例如，Moore等對鼠傷寒沙門菌產生的α-門冬氨酰二肽酶進行了改良，提高了酶的活力。Chen等用此方法在非水相溶液中對枯草桿菌蛋白酶E的活性進行了改良。

使用該方法易出現同型堿基轉換，可以說這種方法是最為基礎的方法，缺點也比較明顯。如何改善其費時、費力等缺點將是改進技術的重點。

2.2 DNA改組（DNA shuffling）

DNA改組是Stemmer于1994年建立的模仿自然進化的一種DNA體外隨機突變方法。DNA改組也叫DNA重排，是對一組同源基因進行體外隨機重組的特殊PCR技術，也叫作基因洗牌術。所謂DNA改組，簡單來說，就是將DNA拆散后重排，即將目的基因在DNaseI的作用下隨機酶切成20～50 bp的片段混合物，然后通過多次無引物PCR循環，各片段之間互為模板和引物，在擴增的過程中進行隨機組合，最終獲得發生多個突變位點的全長基因。

DNA改組可使酶的2個或更多的已優化性狀合為一體。因此，在理論和實際上，都優于連續易錯PCR。總體來說，該技術簡便、高效，已逐漸成為分子改造的主干技術。利用DNA改組，Stemmer等成功實現了對β-內酰胺酶的定向進化，提高了水解頭孢類抗生素的能力。Yano等人用該方法進化天冬氨酸轉氨酶，結果顯示支鏈氧代氨基酸的活力提高了105倍。

2.3 隨機引發重組（RPR）

RPR技術是Aronld于1998年首先報道的。其基本原理是以單鏈DNA為模板，隨機擴增出有重疊片段模板的小片段，由于堿基錯配和錯誤引發，使這些小片段中也存在少量的突變。在隨后的PCR反應中，這些片段互為引物進行合成，隨之這些突變也發生重組，組裝成完整的基因。

RPR技術與DNA改組相比，具有如下特點：①所需親代DNA的量較少；②無需DNase I的處理，解決了DNA改組中DNase I所具有的序列偏向性；③組裝前不需進行純化操作。

2.4 交錯延伸技術（StEP）

StEP是Aronld等人于1998年建立的一種新的體外重組方法。其原理是，在PCR反應中把常規的退火和延伸合并為一步，新生鏈再作為引物與模板進行退火和延伸，如此重復進行，直到獲得全長基因。Bulter等通過易錯PCR、交錯延伸重組等方法對漆酶（一種含銅多酚氧化酶）進行了體外定向進化，篩選得到的突變酶的總活力比原酶提高了160倍。

近年來，新技術大量涌現，以上述幾種方法為基礎的各種新方法不斷出現，如過渡模板隨機嵌合生長技術（RACHHITT）、外顯子重排（Exon Shuffling）、退火低核苷酸基因重排（DOGS）和增加平截雜合酶法（ITCHY）等方法。通常，在酶定向進化過程中，各種方法并不是獨立的，也沒有哪一種方法是萬能的，因而可通過多種方法的組合，使酶的性質得到更大的提高。

3 討論

基因文庫的構建是酶體外定向進化的基礎。在眾多的基因文庫構建技術中，易錯PCR是最早出現的一種，其后產生的各種各樣的新技術，或是以其為基礎，或是對其進行改良。時至今日，易錯PCR技術仍常被用于文庫的構建。每種方法都有其獨特之處，例如，DNA shuffling是一種產生雜合酶的有效方法，但只能重組2個親本基因，而且只限于產生單雜交文庫；RPR技術可使用單鏈DNA且不需要DNase I的處理；StEP法是一種只依賴于條件嚴格控制的PCR的不同的體外重組法。選擇合適的方法會使定向進化過程變得更加簡單，使結果更趨于理想。

4 結束語

成功的定向進化需要滿足功能實際、目標功能可行、合適的篩選方法等條件。在一定程度上，現實中自然進化的難易度決定了定向突變能否解決實際問題，因而在做選擇之前，要先對所需優化性狀進行可行性分析，應選擇易于優化的性狀進行改良。通常來說，使用上述技術可實現已有性狀的優化，但是創造全新性狀的新酶，是一項艱巨的工作，因為一種新的功能需要新的順序空間，而人們很難預測需要重復多少次才能得到預期的答案，可能會很幸運，很快就得到，也可能會是一個漫長而艱難的過程。

上述定向進化方法幾乎可以運用到生命科學研究的各個領域。目前，體外定向進化的方法不僅被成功地運用在酶的改造上，而且還被成功地運用于DNA的進化（如DNA疫苗等）、酶以外蛋白質的進化（例如提高抗體基因表達、對細胞因子生長因子的改造等）。我們堅信，這些技術方法的進一步完善和更廣泛的運用，必將推動很多領域的發展，實現人類認識自然、改造自然史上的又一次飛躍。

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〔編輯：曹月〕

Enzyme in Vitro Directed Evolution Technology and Developmen

Cheng Mengting

Abstract： The enzyme in vitro directed evolution technology can greatly improve the efficiency of the evolution of enzyme molecules， the enzyme may be unknown spatial structure and catalytic mechanism， in accordance with peoples expectations of achieving specific goals. Enzyme in vitro directed evolution technology for the future development of enzyme engineering is very important enzyme in vitro directed evolution methods and technology made prospects are summarized.

Key words： enzyme； directed evolution； protein engineering； development prospects