新型隱球菌生態學和種群結構研究進展

陶星辰，劉曉英，劉碩然，蘇鴻雁*

（1.大理學院基礎醫學院，云南大理 671000;2.大理學院農學與生物科學學院，云南大理 671003）

新型隱球菌生態學和種群結構研究進展

陶星辰1，劉曉英1，劉碩然2，蘇鴻雁2*

（1.大理學院基礎醫學院，云南大理 671000;2.大理學院農學與生物科學學院，云南大理 671003）

新型隱球菌是廣泛存在于環境中的病原真菌，其流行病學與各個變種的生態學密切相關。近年來，隱球菌病的發病率越來越高，所以研究自然環境中新型隱球菌各個變種的生態學、種群結構以及季節性流行變化，對及時有效地預防和控制隱球菌病的發生與傳播有著重要意義。對國內外自然環境中新型隱球菌各個變種的生態學、種群結構以及季節性的流行變化的研究概況及研究成果進行了概述。

新型隱球菌；生態學；種群結構；季節性變化

新型隱球菌（Cryptococcus neoformans）屬于擔子菌門Basidiomycota、銀耳綱Tremenomycetes、銀耳目Tremellales、銀耳科Tremellaceae、隱球菌屬Cryptococcus，為酵母樣真菌，其屬名源于希臘語“kryptos”，意為隱藏的意思，即不能產生內生孢子〔1〕。該菌于1894年被確認為是一種人的致病菌，是由Otto Busse、Hora?ham Buschke和Sanfelice分別從人體和桃汁中分離出來并予報道的〔2〕。目前將新型隱球菌分為3個變種，即格魯比變種Cryptococcus neoformans var.grubii，新生變種Cryptococcus neoformans var.neoformans和格特變種Cryptococcus neoformans var.gattii。根據新型隱球菌細胞外莢膜多糖的抗原性差異，將新型隱球菌分為A、B、C、D和AD 5種血清型〔3〕。這種分類法成為新型隱球菌經典的分類法，為分類學研究、流行病學研究和毒力因子研究奠定了基礎。新型隱球菌屬于環境來源的病原真菌，其流行病學和各個變種的生態學密切相關。目前我國尚未對不同地理環境下新型隱球菌進行系統調查研究，故對環境中新型隱球菌變種的研究進行概述。

1 新生隱球菌

在20世紀70年代中期，Kwon-Chung等〔4〕將新型隱球菌分為兩類：新生變種（血清型A、D和AD型）和格特變種（血清型B和C）。到了20世紀90年代末期，Franzot等通過對URA5基因的核苷酸序列分析研究發現，血清型A菌株的URA5基因的核苷酸序列平均相差（3.0±1.7）bp，而血清型D菌株的URA5基因核苷酸序列平均相差（7.2±3.4）bp，血清型A與血清型D之間堿基差異為（41.9±2.7）bp，通過系統發育圖也可發現血清型A和血清型D是兩個完全不同的群組；因此Franzot等承認這些遺傳差異以及之前報道的表型差異，將血清型A從新生變種中分離出來形成一個新的變種即格魯比變種〔5〕。

1.1新生隱球菌生態學新生隱球菌血清型A在全世界廣泛分布，而血清型D則主要分布在歐洲地區〔6〕。它們與鳥糞之間存在著某種聯系，尤其是鴿糞〔7〕。在自然界中，鳥類的體內平均溫度達42.5℃，而該溫度會抑制隱球菌生長，鴿子很少感染隱球菌，Swinne-Desgain等〔6〕研究發現鴿子的喙、爪子和羽毛也可以作為新生隱球菌的傳播媒介。新鮮鴿糞中高濃度的氨也會抑制其生長，相比之下，暴露于空氣中的干燥鴿糞中會比較容易分離到新生隱球菌。干燥鴿糞為新生隱球菌提供了一個天然的優良生長環境，在此環境中，新生隱球菌可以分解代謝高濃度的尿素、兒茶酚胺和其它含氮化合物，為其生長提供能量〔8〕。近年來，不斷有新生隱球菌從世界各地不同樹種中分離出的報道，包括在阿根廷、哥倫比亞、巴西、印度、南非和泰國。同樣有報道，新生隱球菌也可以從蝙蝠洞、腐爛的蔬菜、水果、昆蟲、乳制品和土壤中分離，但無論是陽性率還是生物量都遠低于鴿糞標本〔6〕。

1.2新型隱球菌新生變種種群結構（血清型D）由于對新型隱球菌血清型D（VNⅣ）的研究相對較少，繼而與它們種群相關的信息十分有限。通過MLEE技術對新型隱球菌新生變種遺傳多樣性進行初步探索，并且從6株地理分布不同的血清型D菌株之間鑒定出5種基因型〔9〕。隨后的研究中，使用不同的遺傳標記和不同來源的菌株，在血清型D菌株種群內并沒有發現基因重組〔10〕。

雖然無性繁殖是新生隱球菌主要的繁殖形式，但是AD雜合菌株的出現表明新生隱球菌種群之間可以發生重組。在臨床與環境中的血清型A和D菌株中，MATɑ和a型菌株數的比例為40:1，顯示出MATɑ型所處的明顯優勢地位〔10〕。AD雜合菌株交配型等位基因比例相對均衡，因為大多數雜合菌株具有兩種交配型等位基因，在雜合過程中，其中一些從血清型D菌株中獲得MATa和從血清型A菌株中獲得MATɑ，而另外一些則從血清型D菌株中獲得MATɑ和從血清型A菌株中獲得MATa；在對兩個多態核基因序列分析中發現，14株AD雜合菌株的每個位點含有不同的等位基因；一個等位基因類似于血清型A菌株，另一個則類似于血清型D菌株。由于血清型D菌株樣本數量較少，因此血清型D菌株種群結構與地理區域分布的關系并沒有被系統研究〔6〕。

1.3新型隱球菌格魯比變種種群結構（血清型A）全世界90%以上的隱球菌病是由新型隱球菌格魯比變種引起的。該變種廣泛存在于環境中，如今已成功地從土壤、腐爛的樹木以及鳥類糞便中分離得到，以陳舊的鴿糞最常見〔11〕，其種群結構和分子流行病學已經得到廣泛研究。早期，多位學者通過RFLP〔12〕、多位點酶電泳〔13〕和PCR指紋技術〔14〕對血清型A菌株進行分子流行病學方面的研究，研究發現血清型A菌株種群之間具有較低的遺傳多樣性。此研究結果后來被Jianping Xu等〔6〕所證實，他分析了314株血清型A菌株的3個基因位點和一個線粒體基因座，在全球種群抽樣中未發現地理區域分布的差異性。Boekhout等人〔15〕選用來自13個國家的96株臨床和環境菌株，通過AFLP基因分型并分析遺傳多樣性，也得到了類似的結果。同樣，Lit?vintseva等〔16〕在美國利用AFLP技術對臨床和環境中血清型A菌株進行基因分型并分析它們的遺傳多樣性，結果發現血清型A菌株種群之間具極低水平的遺傳變異性。此外，早期的研究表明，無論是在環境中還是臨床上，擁有等位基因MATɑ血清型A菌株都占主導地位〔17〕。

全球血清型A菌株的種群包括3個亞群：VNⅠ、VNⅡ和VNB。VNⅠ和VNⅡ世界范圍內廣泛分布，而VNB僅分布于非洲〔18〕。AFLP和DNA指紋技術用于VNⅠ和VNⅡ亞種群分布的研究。VNⅠ分布廣泛，具較低的遺傳多樣性，VNⅡ相對罕見且主要從臨床標本中分離得到。2003年，在博茨瓦納發現不尋常的血清型A臨床菌株之后，學術界對格魯比變種種群結構的認識發生改變，格魯比變種種群可以發生高度遺傳變異，MATa交配型在實驗條件下能夠發生配對和重組〔19〕。先前認為MATa交配型菌株已經滅絕，但在2000年〔20〕和2001年〔21〕，MATa交配型菌株首次被報道仍然存在。在隨后的調查研究中，通過MLST方法對博茨瓦納格魯比變種種群進行基因分型，結果發現博茨瓦納格魯比變種種群非常多樣化且多數分布在非洲南部〔18〕。Bovers等〔8〕對117株新生隱球菌和格特隱球菌的6個基因位點進行系統發育分析，證實血清型A的3個基因型確實存在，且發現VNB菌株不完全局限于非洲南部。Ngamskulrungroj等〔22〕通過MLST研究同樣也發現少數VNB菌株分布在美國南部地區，來自其他地域VNB菌株間的遺傳多樣性顯著低于非洲VNB菌株，另外，在不是非洲來源的VNB菌株中未發現交配型等位基因MATɑ。總體而言，目前的數據表明，雖然少數VNB菌株可分布在非洲以外地區，但大多數VNB菌株仍局限于撒哈拉以南地區，主要從非洲可樂豆樹Colophospermum mopane的腐洞中分離獲得〔6〕。

Jianghan Chen等〔23〕通過MLST技術對中國大陸16省的120株新生隱球菌（血清型A，MATɑ）研究發現，中國新生隱球菌是區別于VNⅠ標準菌株的一個亞群VNⅠc，VNⅠc世界性分布并非中國獨有。VNⅠc是否是最常見的基因型尚不清楚，因為目前在中國只研究分析了臨床菌株，Jianghan Chen等〔23〕認為環境中新生隱球菌的分離及分子分型將會對中國VNⅠc與健康人群之間感染關系的研究提供重要數據。

2 新型隱球菌格特變種（血清型B和血清型C）

新型隱球菌格特變種通過分子指紋技術（mo?lecular fngerprinting）和基因系譜（gene genealogical analyses）分析將其分為4個基因型：VGⅠ、VGⅡ、VGⅢ和VGⅣ〔24〕。

2.1新型隱球菌格特變種生態學環境抽樣分析表明4種基因型與腐木、樹皮及土壤關系密切，尤其是桉樹。1990年Ellis等報告由澳洲赤桉Eucalyptus camalduensis分離出新型隱球菌格特變種，并提出該變種的臨床感染病例分布與該植物的地理分布一致的觀點〔25〕。然而，尚未清楚桉樹中格特變種高陽性率是與桉樹本身有關，還是實驗偏差。最初格特變種采樣主要集中于三大洲，即澳洲、亞洲、北美，采樣植物主要是赤桉及其他桉樹品種；以往的文獻研究表明，桉樹作為采樣標本的頻率遠遠高于其他植物品種。其實，格特變種同樣也分布于其他樹種中。在印度，格特變種可從當地樹木中，如印度楝Azadirachta indica、羅晃子Tamarindus indica、芒果樹Mangifera indica、閻浮樹Syzygium cumini等中分離出；在南美，在扁桃樹Terminalia catappa中分離獲得格特變種；在北美，溫哥華島上的花旗松Pseu?dotsuga menziesii、榿木Alnus rubra及西北太平洋地區其他的樹木都可以分離出格特變種〔6〕。

我國從澳洲引進赤桉歷史久、地域廣，從17°～33°N均有大片的赤桉種植區，如江西、廣西、廣東等地區，李安生和吳紹熙等人選擇在6月份和11月份兩次采集該樹樹葉、樹皮、花和花蕊、腐敗木質和土壤等標本819個，接種于1 600多個CACA平皿，結果未分離到格特變種，李安生和吳紹熙等認為可能和該樹種在我國自然環境下生長之后發生適應性變化，和自然生長環境因子有關，此外，也可能與該地區引種的赤桉系由種子培育而成，原始攜帶的隱球菌孢子量相對較少也有一定的關系〔26〕。

2.2新型隱球菌格特變種種群結構目前，大多數新型隱球菌變種系統地理學研究應用的是來自不同基因型的組合數據，并不能為每個基因型的多樣性評估提供充分有效的解決方案〔10〕。Kidd等〔24〕對新型隱球菌格特變種做了全面的系統學分析，解決了評估遺傳多樣性和全球VGⅡ基因型種群結構這一世界性課題。在這項研究中，Kidd等〔24〕分析了來自不同地理區域的VGⅠ和VGⅡ基因型的4個基因位點，但未發現種群間的地理隔離。另外，他們觀察到菌株之間的差異和地理距離之間沒有相關性。同樣，Fraser等〔27〕采用多位點遺傳分析方法對新型隱球菌格特變種種群遺傳多樣性進行分析，得出相同的結果。

研究結果表明，溫哥華持續爆發的隱球菌病與VGⅡ基因型密切相關，主要是VGⅡa和VGⅡb亞型，且已經蔓延到不列顛哥倫比亞省〔10〕。VGⅡa亞型主要分布在太平洋西北地區。在2008年和2009年，從俄勒岡的動物體內和臨床中發現了一個新的基因亞型VGⅡc〔28〕。

總而言之，綜合地理采樣和更精準的遺傳分析相結合的分析方法，將提高人們對新型隱球菌格特變種的全球種群結構和起源的理解〔6〕。

3 新型隱球菌季節性流行變化

近年來印度學者Randhawa H.S.研究了印度西北地區，在不同樹種腐洞中格魯比變種和格特隱球菌流行的季節變化。研究發現，格魯比變種和格特隱球菌在秋季的分離率是最高的，其次是在夏季。對于格特隱球菌而言，其在冬季的流行率是最低的，而格魯比變種最低的流行率則發生在雨季。同樣，在泰國北方地區對雞糞中新型隱球菌的一項調查研究中，也出現了相同的結果〔29〕。Granados等〔30〕做了一項回顧性的研究，他們在哥倫比亞的4個城市研究分析了樹樣中不同種類的新型隱球菌的流行率與氣候條件的關系，發現格魯比變種比格特隱球菌更耐熱，但過多的水分不利于其生長。1992年至2004年期間，Kidd等〔31〕在哥倫比亞的4個城市做了一項關于在一定氣候條件下樹樣中不同血清型的新型隱球菌分離率的回顧性研究，研究發現在陽性的樣本中，56.5%是血清型B，24.7%是血清型C，18.8%是血清型A，結果表明環境氣候條件主要是濕度、溫度和太陽輻射會通過不同方式影響樹木中不同血清型的新型隱球菌的流行率。2007年，Kidd等〔32〕在加拿大的不列顛哥倫比亞和美國西北部地區的一份環境調研報告中指出，在溫和、干燥和較低的相對濕度的夏季（5～8月份）格特隱球菌的菌落的群體密度顯著高于寒冷、潮濕和較高的相對濕度的月份。目前我國已有報道格特變種感染的臨床病例，然而國內尚缺乏對種植的澳洲赤桉分離到該變種的報道〔25〕，也未有新型隱球菌季節性流行變化研究的相關報道。

4 展望

近幾十年來，侵襲性真菌感染的發病率在全球范圍內呈現出持續上升趨勢，已成為住院患者致死病殘的主要威脅之一，隱球菌是遍布大自然界的一種擔子菌病原體，是全球最常見的中樞神經系統（CNS）感染病原體之一。隨著國外對自然環境中新型隱球菌研究的深入，國內新生隱球菌和格特隱球菌的生態學研究、種群結構研究和季節性流行變化成為重要的流行病學研究課題，加強對新型隱球菌生態學和種群結構的研究是我們所要面臨的任務。

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*通信作者：蘇鴻雁，教授.

（責任編輯 毛本勇）

Progresses and Perspectives of Ecology and Population Structure ofCryptococcus neoformans

TAO Xingchen1,LIU Xiaoying1,LIU Shuoran2,SU Hongyan2*
（1.Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.College of Agriculture and Biology Science,Dali University, Dali,Yunnan 671003,China）

Cryptococcus neoformans is a pathogenic fungi which is widely spread in the environment,and its epidemiology is closely related to the ecology of the various variants.In recent years,with the gradual increasing of cryptococcosis incidence,the study of ecol?ogy of its various variants,population structure in natural environment and changes in seasonal epidemics has great significance for ef?fective prevention and control of the occurrence and transmission of cryptococcosis.This paper reviews the advancements in the study of ecology,population structure in natural environment and changes in seasonal epidemics of Cryptococcus neoformans at domestic and abroad.

Cryptococcus neoformans;ecology;population structure;seasonal change

R379.5

A

1672-2345（2014）06-0066-05

10.3969∕j.issn.1672-2345.2014.06.017

國家自然科學基金資助項目（31060019；31100093）；云南省教育廳重大專項資助項目（ZD2010010）；云南省中青年學術帶頭人資助項目（2012HB-042）

2013-12-08

2013-12-18

陶星辰，碩士研究生，主要從事微生物及微生物疾病研究.