LKB1和血管內皮生長因子在胃癌組織中的表達及其臨床意義

黃悅 夏雷 莫伏根 徐新宇

LKB1和血管內皮生長因子在胃癌組織中的表達及其臨床意義

黃悅 夏雷 莫伏根 徐新宇

目的探討LKB1和血管內皮生長因子（VEGF）在胃癌中的表達及臨床意義。方法采用免疫組織化學（SP）法檢測115例胃癌組織和20例胃正常組織中LKB1和VEGF的表達，并探討其與胃癌分期、淋巴結轉移、Lauren's分型及預后的關系。結果LKB1在胃癌組織中的陽性率為20.9%，低于正常胃組織中的95.0%（P＜0.01）；VEGF在胃癌組織中的陽性率為64.3%，高于正常胃組織中的5.0%（P＜0.01）。LKB1在胃癌組織中的低表達與胃癌的TNM分期、淋巴結轉移、Lauren's分型及預后有關（P＜0.05）；VEGF在胃癌中的表達與淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期及預后相關（P＜0.05）。結論LKB1的低表達與胃癌的發生、發展有關，對胃癌惡性生物學行為的評估及預后判斷具有重要的指導意義。

胃癌；LKB1；血管內皮生長因子；免疫組織化學

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率均居我國惡性腫瘤的前二位［1］，胃癌的發生和發展涉及到多種基因、多種分子，故在基因水平上找尋新的預后指標對胃癌的研究有著深刻的意義。LKB1又被稱為STK11（serine theronineprotein kinase 11），是一種抑癌基因，編碼一種絲氨酸?蘇氨酸蛋白激酶，與細胞生長和凋亡、細胞周期改變、細胞極性的維持和胚胎血管發育密切相關，其缺失、突變參與了多種惡性腫瘤的發生、發展［2］。血管內皮生長因子（VEGF）在腫瘤的血管生成中起著關鍵作用，VEGF是目前所知的作用最強的促血管生成因子。本研究通過檢測LKB1和VEGF在人胃癌組織中的表達，觀察LKB1與VEGF之間的關系，進而探討其在胃癌生長和轉移過程中的作用及其與臨床病理特征之間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 115例胃癌標本，均為江蘇省腫瘤醫院2006年1～12月手術切除標本，且病理證實為原發性胃癌。患者男73例，女42例，年齡37～80歲（中位年齡61歲）。20例胃正常組織取自于距癌組織＞5 cm的切緣正常黏膜組織?；颊咝g前均無輔助化療或內分泌治療史。所有病例均經病理證實，同時依據病人病變部位、侵犯深度、淋巴結轉移、TNM分期、Lauren's分型及有無神經脈管侵犯進行分組。

1.2 方法 所有標本均經10%福爾馬林溶液固定、石蠟包埋、連續4μm切片，分別進行HE和SP免疫組化染色。檢測所用特異性一抗為鼠抗人LKB1單克隆抗體ab15095（美國Abcam公司產品），工作濃度1∶100；鼠抗人VEGF單克隆抗體（上海長島生物技術有限公司）工作濃度1∶200。采用免疫組化SP法染色，石蠟切片脫蠟、水化、自來水沖洗。根據第一抗體要求對組織進行相應的抗原修復。PBS沖洗3次，每次3 min，滴加第一抗體，4℃過夜。PBS沖洗3次，每次3 min，除去PBS，滴加生物素標記的第二抗體，室溫孵育15 min。PBS沖洗3次，每次3min，除去PBS，滴加新鮮配制的DAB顯色試劑顯色。自來水沖洗終止顯色，蘇木素復染，PBS返藍。經梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。染色過程中設陽性和陰性對照。陽性對照用已知陽性切片，陰性對照用PBS代替一抗。

1.3 結果判斷 對免疫組化結果進行雙盲閱片，參照Kountourakis等［3］的研究標準：LKB1以胞漿或胞核有棕黃色顆粒沉著為陽性，VEGF以胞漿有棕黃色顆粒沉著為陽性；判斷標準：－：無染色或者＜10%腫瘤細胞表達；＋：＞10%輕微或者幾乎很少部分表達；＋＋：全部細胞膜弱到中度染色或者＞10%胞漿弱到中度表達；＋＋＋：＞10%腫瘤細胞強表達。我們以＋＋、＋＋＋作為有表達（陽性），＋、－作為無表達（陰性）。

1.4 統計學分析 所有數據均采用SPSS 16.0軟件包進行統計。計數資料采用卡方檢驗進行統計；采用Kap?lan?Meier法繪制生存曲線，相關分析采用Spearmen相關性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LKB1和VEGF在胃組織中的表達 LKB1和VEGF在正常胃黏膜組織及胃癌中的表達情況見表1。其中，LKB1在胃癌組織中的陽性率為20.9%，低于正常胃組織中的95.0%（P＜0.01），VEGF在胃癌組織中的陽性率為64.3%，與在正常胃黏膜組織的表達（5%）存在差異（P＜0.01）。

表1 LKB1及VEGF在胃癌及正常胃黏膜組織中的表達情況（n）

2.2 胃癌組織中LKB1及VEGF的表達與臨床病理因素的關系 LKB1在胃癌組織中的表達程度與胃癌的TNM分期、淋巴結轉移、Lauren's分型有關（P＜0.05或0.01）；VEGF在胃癌中的表達與淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期相關（P＜0.05或0.01）。見表2。

表2 胃癌組織中LKB1及VEGF的表達與臨床病理因素的關系（n＝115）

續表

2.3 胃癌組織中LKB1及VEGF表達的相關性 相關分析顯示，胃癌組織中LKB1及VEGF表達呈負相關（r＝－0.199，P＜0.05）

LKB1＋－VEGF＋11 63－13 28

2.4 胃癌組織中LKB1及VEGF的表達與預后的關系 Kaplan?Meier回歸分析顯示，LKB1及VEGF的表達與預后顯著相關（P＜0.05）；見圖1。

3 討論

1998年由Hemminki等采用定位候選克隆的方法從黑斑息肉綜合征（Peutz?Jeghers syndrome PJS）患者的血細胞中克隆出LKB1［4］。LKB1定位于人19p13.13，cDNA全長2158 bp，編碼區1302 bp，有9個外顯子。編碼的LKB1為一種60 kD的由433個氨基酸組成的絲氨酸?蘇氨酸蛋白激酶，含有一個激酶區域（位于50～337密碼子），其N端含有一個核定位信號區和胞漿定位區。LKB1在細胞內分布較廣泛，在胎兒和成人的所有組織中均有表達，且在成人以上皮、睪丸生精小管和肝臟中表達最強。LKB1的主要功能是通過使細胞周期阻滯在G1期而抑制細胞的增殖，促進細胞凋亡［5］。此外，LKB1在調節胚胎血管形成以及細胞極性的誘導等方面也有著重要的生物學意義［6］。目前認為，LKB1的功能異常不僅是PJS的致病因素，同時它還是一個重要的抑癌基因［7］。

LKB1的胚系突變或體細胞突變廣泛存在于多種腫瘤的發生發展中，其作用機制可能與LKB1的胚系突變或體細胞突變，形成破壞LKB1活性的截短蛋白，產生一種失活的絲氨酸?蘇氨酸蛋白激酶有關［8］；當LKB1突變和丟失后，其編碼的蛋白質失去其生物學活性，從而導致腫瘤發生。LKB1的突變更容易誘發肺癌的發生，在所有肺癌組織類型中包括小細胞肺癌都存在LKB1的突變表達。LKB1在腫瘤組織中的表達強度明顯低于正常對照組，且高度惡性組中的表達強度低于低度惡性組［9］。Safe等［10］進一步證實了LKB1基因突變所致的功能缺失，導致了促進肺癌新生血管形成的VEGF及其轉錄因子SP1表達水平的升高，從而促進了腫瘤的轉移。Matsumoto等［11］研究發現LKB1突變產生的截短蛋白在肺癌組織陽性表達率為33%，且Ⅳ期肺癌組織中LKB1突變的陽性率明顯高于Ⅰ期肺癌。Ghaffar等［12］對胰腺導管內乳頭狀黏液腺癌進行研究證實：胰腺癌中同樣存在LKB1基因突變、丟失，其雜合性丟失率為32%，雙等位基因失活率為9%，進一步研究發現LKB1基因早期突變、丟失易促進腫瘤形成，晚期丟失則促進惡性腫瘤的侵襲、轉移。本研究中，LKB1在胃癌組織中的陽性率為20.9%，明顯低于正常胃黏膜組織的95.0%（P＜0.01），且LKB1在胃癌組織中的表達程度與胃癌的TNM分期、淋巴結轉移、Lauren's分型及預后有關（均P＜0.05）。由此，我們認為LKB1蛋白的缺失表達可能與胃癌的發生、發展及轉移密切相關。

圖1 LKB1及VEGF的表達與預后的關系

LKB1抑癌作用的機制可能與其負性調節VEGF有關［10］，LKB1能夠下調VEGF的表達，對腫瘤新生血管產生抑制作用，從而達到抑制腫瘤發生發展的作用。VEGF是控制血管新生的信號因子，其正常調控在胚胎發育和低氧應激中有重要意義。研究表明，LKB1可以調節VEGF的水平。LKB1敲除的老鼠胚胎期即死亡，并伴隨血管發育異常和VEGF表達量的明顯上調，而且，過表達LKB1可下調VEGF的水平［13］。由于血管生成是實體瘤生長所必需的，上述調控關系說明了LKB1調節VEGF對抑制腫瘤生長的重要作用。研究發現，在LKB1與肺腺癌及乳腺癌發生的關系中，LKB1基因突變或缺失可造成胚胎血管發育異常，且能上調胚胎纖維母細胞中VEGF的表達，而VEGF過度表達提示正常組織癌變，這對肺癌及乳腺癌的診斷起重要的指導意義［14］。本研究所顯示的胃癌組織中LKB1及VEGF表達的負相關（r＝－0.199，P＜0.05），提示LKB1蛋白可能通過下調胃癌組織中VEGF的表達，抑制胃癌新生血管產生，從而對胃癌細胞的發生發展起抑制作用。

綜上所述，LKB1可能通過下調胃癌組織中VEGF的表達，抑制胃癌的發生、發展。LKB1基因的低表達可能是胃癌預后不良的重要危險因素。隨著對LKB1的深入研究，為胃癌等惡性腫瘤的診斷和治療提供新的科學依據，并有望為胃癌的基因治療、腫瘤抑制劑的研發提供新的作用靶點。

［1］ 夏雷，莫伏根，李剛，等.胃癌中HER?2和HER?3的表達及臨床意義［J］.實用老年醫學，2013，27（11）：903?907.

［2］ Ylikorkala A，Rossi DJ，Korsisaari N，et al.Vascular ab?normalities and deregulation of VEGF in Lkb12 deficient mice［J］.Science，2001，293（5533）：1323?1326.

［3］ Kountourakis P，Pavlakis K，PsyrriA，etal.Prognostic sig?nificance of HER3 and HER4 protein expression in colorectal adenocarcinomas［J］.BMC Cancer，2006，28（6）：46.

［4］ Hemminki A，Markie D，Tomlinson I，etal.A serine／threo?nine kinase gene defective in Peutz?Jeghers syndrome［J］. Nature，1998，391（6663）：184?187.

［5］ Baas AF，Smit L，Clevers H.LKB1 tumor suppressor protein：PAR taker in cell polarity［J］.Trends Cell Biol，2004，14（6）：312?319.

［6］ Katajisto P，Vaahtomeri K，Makela TP，et al.LKB1 signaling in mesenchymal cells required for suppression of gastrointestinal polyposis［J］.Nat Genet，2008，40（4）：455?459.

［7］ Zhang S，Schafer?Hales K，Khuri FR，etal.The tumor supp ressor LKB1 regulates lung cancer cell polarity bymediating ode42 recruitment and activity［J］.Cancer Res，2008，68（3）：740?748.

［8］ McGarrity TJ，Amos C.Peutz?Jeghers syndrome：clinicopa?thology and molecular alterations［J］.Cell Mol Life Sci，2006，63（18）：2135?2144.

［9］ Slack?Davis J，Dasilva JO，Parsons SJ.LKB1 and Src：an?tagonistic regulators of tumor growth and metastasis［J］. Cancer Cell，2010，17（6）：527?529.

［10］Safe S，Abdelrahim M.Sp transcription factor family and its role in cancer［J］.Eur J Cancer，2005，41（16）：2438?2448.

［11］Matsumoto S，Iwakawa R，Takahashi K，et al.Prevalence and specificity of LKB1 genetic alterations in lung cancers［J］.Oncogene，2007，26（40）：5911?5918.

［12］Ghaffar H，Sahin F，Sanchez Cespedes M，etal.LKB1 pro?tein experssion in the evolution of glandular neoplasia of the lung［J］.Cancer Res，2003，63（15）：2998?3003.

［13］Zhuang ZG，DiGH，Shen ZZ，etal.Enhanced expression of LKBI in breast cancer cells attenuates angiogenesis，invasion，and metastatic potential［J］.Mol Caneer Res，2006，4（11）：843?849.

［14］程忠強，詹曉東.LKB1在腺癌中研究進展［J］.中華全科醫學，2010，2（8）：224?225.

Clinical significance of the expression of LKB1 and vascular endothelial grow th factor in gastric cancinoma

HUANG Yue．Department of Pathology，Nanjing First Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Nanjing 210006，China；XIA Lei，MO Fu?gen，XU Xin?yu．Department of Pathology，Jiangsu Cancer Hospital，Nanjing 210009，China

ObjectiveTo investigate the expression of LKB1 and vascular endothelial growth factor（VEGF）in hu?man gastric cancer tissue and to investigate the clinical significance.M ethodsThe expressions of LKB1 and VEGF in 115 cases of gastric carcinoma and 20 cases of normalgastric tissueswere detected with immunohistochemistrymethod，and the relationship of the expression of LKB1 and VEGF with the clinicopathological parameters of gastric carcinoma was ana?lyzed.ResultsThe positive rate of LKB1 in gastric carcinoma and normal tissueswas 20.9%and 95.0%，respectively（P＜0.01）.The positive rate of VEGF in gastric carcinoma and normal tissues was 64.3%and 5.00%，respectively（P＜0.05）.The low expression of LBK1 was associated with tumor lymph node metastasis，stage，Lauren's classification and worse survival（P＜0.05）；The expression of VEGFwas associated with tumor lymph nodemetastasis，stage，distantmetas?tasis and worse survival（P＜0.05）.ConclusionsLow expression of LKB1 proteinmay play an important role in the de?velopment and progression of gastric cancer.LKB1may be used to assess themalignantbiological behavior and prognosis of gastric cancer.

gastric cancer；LKB1；vascular endothelial growth factor；immunohistochemistry

R 735.2

A

10.3969／j.issn.1003?9198.2014.09.009

2013?12?13）

江蘇省自然科學基金項目（BK2012874）

210006江蘇省南京市，南京醫科大學附屬南京醫院病理科（黃悅）；210009江蘇省南京市，江蘇省腫瘤醫院病理科（夏雷，莫伏根，徐新宇）

徐新宇，Email：redxxy＠163.com