基于蛋白組學的水果蛋白質(zhì)提取方法

, ,*,,

(甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070)

蛋白質(zhì)組學是指在高通量水平上研究蛋白質(zhì)的特征,包括表達、翻譯后的修飾、互作等內(nèi)容。所涉及的技術包括蛋白質(zhì)提取、分離、鑒定以及生物信息學分析等,其中蛋白質(zhì)的提取是重要的過程[1]。由于水果組織中蛋白含量極低,加之富含蛋白酶及存在大量干擾物質(zhì),為后續(xù)的分析帶來了諸多困難[2-3]。因此,選擇適宜的水果蛋白質(zhì)提取方法對開展蛋白質(zhì)組學的研究就顯得十分必要。目前,基于蛋白組學的水果蛋白質(zhì)提取的方法均借鑒于其他植物材料,主要包括四種,分別是酚抽提法、SDS法、裂解液法以及三氯乙酸-丙酮法。本文對這些方法的特點及應用兩方面進行了綜述,旨在推薦適宜的提取方法,為水果蛋白組學的研究提供參考。

1 提取方法

1.1 酚抽提法

此法源于Hurkman[4]等人對植物細胞膜蛋白的提取。操作過程是取冷凍的組織,加入含有Tris-飽和酚和提取緩沖液(蔗糖,Tris-HCl,乙二胺四乙酸(EDTA),KCl,β-巰基乙醇,苯甲基磺酰氟(PMSF))研磨,離心取酚相,剩余液體用Tris-飽和酚繼續(xù)提取、離心收集酚相,加入醋酸銨的丙酮溶液離心,再用醋酸銨的丙酮溶液、丙酮、乙醇分別洗滌沉淀,冷凍干燥沉淀后獲得蛋白。由于該法可以有效地除去鹽離子、酚類、糖類和色素等大量干擾物質(zhì),加之酚是強的蛋白變性劑,可以使蛋白質(zhì)變性析出[5],因此可獲得純度較高的蛋白質(zhì),但該法操作過程較為繁瑣。

酚抽提法現(xiàn)已廣泛應用于水果蛋白質(zhì)的提取[6]。陳虎等[7]利用該法獲得了南豐蜜桔果皮中的蛋白質(zhì),提取率較高,得到的蛋白呈乳白色,易溶解。盧丞文等[8]采用高濃度Tris抑制蛋白酶的活性,采用提取緩沖液(蔗糖,Tris-Hcl,EDTA,KCl,β-巰基乙醇,PMSF)進行兩次提取,充分去除干擾物質(zhì),從粉紅果番茄果實中得到了純度較高的蛋白質(zhì)。Deytieux等[9]對該法進行了改良,他們將收集完酚相后的粗蛋白置于醋酸銨-甲醇溶液中,-20℃過夜沉淀,之后再用乙酸銨-甲醇溶液、冷甲醇、冷乙醇分別洗滌,得到了純度較好的葡萄果皮蛋白質(zhì)。Negri等[10]運用該法建立了葡萄果實細胞壁蛋白的提取方法,蛋白得率較高。

表1 果實蛋白提取的四種方法的比較Table 1 Comparison of four protein extraction methods of fruit

1.2 三氯乙酸-丙酮法(TCA-丙酮法)

水果蛋白質(zhì)提取的經(jīng)典方法,源于Damerval[11]等對小麥幼苗蛋白的提取。操作過程是取冷凍的組織,加入TCA-丙酮研磨,離心得到蛋白質(zhì)沉淀,用丙酮洗滌沉淀、離心,冷凍干燥沉淀。三氯乙酸和丙酮都是有效的蛋白沉淀劑,兩者通常結(jié)合使用以除去果實組織中含有的大量的以各種形式存在的可溶性非蛋白干擾物質(zhì),主要包括多酚、萜類和有機酸等[12]。此法最大的缺點是沉淀不完全會造成蛋白質(zhì)的損失以及沉淀后得到的蛋白質(zhì)難溶于裂解液中,且得到的蛋白質(zhì)純度不高,其中含有較多的雜質(zhì)[13],這些都為后續(xù)的研究帶來困難,故其應用受到限制。因此,需在提取過程中加入EDTA和Triton X-100等除鹽劑以及還原劑(二硫蘇糖醇(DTT)、β-巰基乙醇)和蛋白酶抑制劑PMSF等保持蛋白穩(wěn)定性的試劑,然后再用TCA-丙酮沉淀,可以獲得良好的提取效果[14]。

該法較適用于果皮中蛋白質(zhì)的提取。鄧貴明等[15]利用該法提取了柑橘果皮中的蛋白質(zhì),所得蛋白質(zhì)量大且純度高。楊愛珍等[16]用該法對桃果實硬核后期果皮中的蛋白進行了提取,獲得了純度高的蛋白質(zhì)。鐘鳳林[17]利用改良的該法提取了琯溪蜜柚果實汁胞中的蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)得率較高。王一鳴[18]采用優(yōu)化的該法提取了硬核期桃果皮中的蛋白質(zhì),得到了純度較高的蛋白質(zhì)。Jean[19]等用該法獲得了得率較高的葡萄果皮蛋白質(zhì)。

1.3 SDS法

此法的特點是在提取緩沖液中加入十二烷基磺酸鈉(SDS)。操作過程是取冷凍的組織,加入含有SDS的提取液研磨,離心,加入丙酮形成沉淀,再離心,取沉淀用丙酮洗滌至無色,冷凍干燥沉淀后獲得蛋白。該法往往與酚法或TCA-丙酮法相結(jié)合。經(jīng)SDS優(yōu)化后的酚法和TCA-丙酮法,蛋白質(zhì)的得率及純度明顯提高。由于SDS是一種陰離子去垢劑,因此要通過多次洗滌蛋白沉淀去除[20]。SDS具有很高的蛋白質(zhì)結(jié)合能力,尤其是在高溫條件下(95℃)可提高與膜蛋白的親和力,同時在細胞裂解和蛋白提取過程中可抑制酶的活力[21]。

馬斌等[22]在酚抽提法的基礎上,通過在提取液中加入SDS,獲得了得率及純度較高的枇杷果實蛋白質(zhì)。Wang等[23]結(jié)合TCA-丙酮法和酚法,通過加入了SDS,建立了一種適于多種果實蛋白提取的方法,得率高,所含雜質(zhì)較少。Song等[24]運用TCA-丙酮法、熱SDS緩沖液提取結(jié)合TCA-丙酮沉淀提取了蘋果和香蕉果實果皮及果肉中的蛋白質(zhì),對于蘋果果皮來說,SDS法的蛋白得率最高,雜質(zhì)最少。

1.4 裂解液法

也稱為尿素-硫脲法,運用溶解蛋白質(zhì)沉淀的裂解液直接提取蛋白質(zhì),其主要成分為尿素、硫脲、Tris-HCl、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、DTT等[25]。操作過程是取冷凍的果實組織,加入裂解液研磨。靜置后離心,再加入丙酮靜置過夜。次日離心,收集沉淀并用丙酮洗滌至無色,冷凍干燥沉淀。用該方法提取的蛋白質(zhì)雜質(zhì)少,但相對于前幾種方法蛋白質(zhì)得率低,所得的沉淀需反復洗滌去除裂解液。

鄭誠樂等[26]利用該法提取得到的粗提物含量較高,經(jīng)過沉淀、溶解后蛋白質(zhì)得率高、雜質(zhì)少。Barraclough等[27]利用該法結(jié)合丙酮沉淀提取了蘋果、鱷梨、檸檬和桃等果實中的蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)得率及純度均較高。

2 四種方法的比較

上述各種方法均有其各自的特點。李開拓等[28]比較了酚法和TCA-丙酮法提取荔枝果皮中總蛋白質(zhì)的效果,酚法得到的蛋白質(zhì)含量較高。金良[29]等認為酚法所得葡萄果實蛋白質(zhì)純度高于TCA-丙酮法。吳滿成等[30]分別用酚法和TCA-丙酮法提取了牛奶子果實中的蛋白質(zhì),后者的蛋白得率略高于前者,但純度低于前者。王卓等[31]比較了酚抽提法和TCA-丙酮法提取香蕉果實中總蛋白質(zhì)的提取效果,前者所得蛋白質(zhì)量大且純度高。王清等[6]建立了適用于甜櫻桃、桃、蘋果、芒果和冬棗等多種果實的蛋白提取方法,用酚抽提法提取的蛋白質(zhì)數(shù)量明顯多于TCA-丙酮法。Saravanan等[32]利用酚法、TCA-丙酮法及改良的TCA-丙酮法提取番茄、鱷梨、香蕉和橙等果實組織中的蛋白質(zhì),并比較了提取效果,發(fā)現(xiàn)酚法的蛋白得率總體上都高于其他兩種方法,對于鱷梨、香蕉和橙子,TCA-丙酮法和改良的TCA-丙酮法蛋白質(zhì)得率低且雜質(zhì)較多,而酚法效果較好。Vincent等[33]對比了酚法、TCA-丙酮法、SDS法對葡萄果實蛋白質(zhì)的提取效果,酚法在蛋白得率和2D電泳效果方面都優(yōu)于SDS法和TCA-丙酮法。王海玲[34]等用改良的酚法、SDS法、尿素/硫脲法提取了桑葚中的蛋白質(zhì),無論是純度還是得率均以酚法最好。Isaacson等[35]比較了酚法和TCA-丙酮法,認為酚法更適用于復雜的頑拗植物組織如成熟葡萄果粒、香蕉果實等的蛋白質(zhì)提取。

3 結(jié)論

綜上所述,四種提取方法各有其優(yōu)劣。由于果實的種類和品種、部位以及成熟度不同,故在具體操作中還需對酚法的提取過程進行進一步的優(yōu)化,如采用高濃度Tris-飽和酚、抑制蛋白酶的活性、增加提取次數(shù)或與其他方法結(jié)合。考慮到目前的提取方法普遍存在蛋白質(zhì)中雜質(zhì)偏多,以及提取液殘留等問題,因此,除雜仍然是提取蛋白質(zhì)中需要細化的內(nèi)容。同時,還需要開發(fā)簡單、快速而又有效的提取新方法。

[1]田世平,羅云波,王貴禧.園藝產(chǎn)品采后生物學基礎[M].北京:科學出版社,2011:299-312.

[2]Rodrigues S P,Ventura J A,Zingali R B,etal.Evaluation of sample preparation methods for the analysis of papaya leaf proteins through two-dimensional gel electrophoresis[J]. Phytochemical Analysis,2009,20(6):456-464.

[3]王英超,黨源,李曉艷,等.蛋白質(zhì)組學及其技術發(fā)展[J].生物技術通訊,2010,21(1):139-144.

[4]Hurkman W J,Tanaka C K.Solubilization of plant membrane proteins for analysis by two-dimensional gel electrophoresis[J]. Plant Physiology,1986,81(3):802-806.

[5]Carpentier S C,Witters E,Laukens K,etal.Preparation of protein extracts from recalcitrant plant tissues:An evaluation of different methods for two-dimensional gel electrophoresis analysis[J].Proteomics,2005,5(10):2497-2507.

[6]王清,產(chǎn)祝龍,秦國政,等.果實蛋白質(zhì)組學研究的實驗方法[J].植物學報,2009,44(1):107-116.

[7]陳虎,何新華,羅聰,等.南豐蜜桔貯藏期間果皮褐變的蛋白質(zhì)組分析[J].熱帶作物學報,2011,32(12):2235-2239.

[8]盧丞文,潘曉琪,田慧琴,等.番茄果實中蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳條件的優(yōu)化[J].食品科技,2010,35(10):196-200.

[9]Deytieu C,Genyl,Lapaillerie D.Proteome analysis of grape skins during ripening[J].Journal of Experimental Botany,2007,58(7):1851-1862.

[10]Negri A S,Prinsi B,Scienza A,etal.Analysis of grape berry cell wall proteome:a comparative evaluation of extraction methods[J].Journal of Plant Physiology,2008,165(13):1379-1389.

[11]Damerval C,Vienne D,Zivy M,etal.Technical improvements in two-dimensional electrophoresis increase the level of genetic variation detected in wheat-seedling proteins[J]. Electrophoresis,1986,7(1):52-54.

[12]Granier F.Extraction of pant proteins for two-dimensional electrophoresis[J].Electrophoresis,1988,9(11):712-718.

[13]Wang W,Vignani R,Scali M,etal.A universal and rapid protocol for protein extraction from recalcitrant plant tissues for proteomic analysis[J].Electrophoresis,2006,27(13):2782-2786.

[14]張麗,羅海波,姜麗,等.果實成熟衰老過程中蛋白質(zhì)組學研究進展[J].植物生理學報,2011,47(9):861-871.

[15]鄧貴明,繼吾,姜波,等.柑橘葉片和果皮總蛋白質(zhì)提取及雙向電泳體系的建立[J].熱帶亞熱帶植物學報,2012,20(1):19-25.

[16]楊愛珍,王一鳴,花寶光,等.桃果實硬核后期中果皮與內(nèi)果皮中蛋白質(zhì)組表達的雙向電泳分析[J].中國農(nóng)業(yè)通報,2010,26(14):59-64.

[17]鐘鳳林.琯溪蜜柚汁胞發(fā)育過程的差異蛋白質(zhì)組學研究[D].福州:福建農(nóng)林大學,2009.

[18]王一鳴,花寶光,王有年,等.桃果實蛋白質(zhì)雙向電泳影響因素的研究[J].園藝學報,2007,34(6):244-249.

[19]Sarry J E,Sommerer N,Sauvage F X,etal.Grape berry biochemistry revisited upon proteomic analysis of the mesocarp[J].Proteomics,2004,4(1):201-215.

[20]徐幼平,徐秋芳,蔡新忠.適于雙向電泳分析的番茄葉片總蛋白提取方法的優(yōu)化[J].浙江農(nóng)業(yè)學報,2007,19(2):71-74.

[21]Harder A,Wildgruber R,Nawrocki A,etal.Comparison of yeast cell protein solubilization procedures for two-dimensional electrophoresis[J].Electrophoresis,1999,20(4-5):826-829.

[22]馬斌,孫駿威,余初浪,等.枇杷葉片和果實總蛋白質(zhì)提取及雙向電泳的優(yōu)化方法[J].果樹學報,2011,28(2):358-362.

[23]Wang W,AI F J,CHen SH N.Optimizing protein extraction from plant tissues for enhanced proteomics analysis[J].Journal of Separation Science,2008,31(11):2032-2039.

[24]Song J,Braun G,Bevis E,etal.A simple protocol for protein extraction of recalcitrant fruit tissues suitable for 2-DE and MS analysis[J].Electrophoresis,2006,27(15):3144-3151.

[25]皇甫海燕,官春云,郭寶順,等.蛋白質(zhì)組學及植物蛋白質(zhì)組學研究進展[J].作物研究,2006,20(z1):577-581.

[26]鄭誠樂,鐘鳳林,潘東明,等.錐栗果實雙向電泳體系的建立[J].福建農(nóng)林大學學報:自然科學版,2010,39(5):475-479.

[27]Barraclough D,Obenland D,Laing W,etal.A general method for two-dimensional protein electrophoresis of fruit samples[J]. Postharvest Biology and Technology,2004,32(2):175-181.

[28]李開拓,郭志雄,潘東明,等.荔枝果皮總蛋白質(zhì)提取及雙向電泳體系的建立[J].熱帶亞熱帶植物學報,2011,19(1):69-74.

[29]金良,陳尚武,馬會勤.葡萄蛋白質(zhì)組學研究進展[J].中國生物工程雜志,2010,30(10):100-107.

[30]吳滿成,胡海濤,余有見,等.牛奶子果實中蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法的改良[J].植物生理學通訊,2009,45(7):695-698.

[31]王卓,賈彩虹,金志強.香蕉果實高質(zhì)量總蛋白的提取方法[J].果樹學報,2009,26(3):414-417.

[32]Saravanan R S,Rose J K C.A critical evaluation of sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of recalcitrant plant tissues[J].Proteomics,2004,4(9):2522-2532.

[33]Vincent D,Wheatley M D,Cramer G R.Optimization of protein extraction and solubilization for mature grape berry clusters[J].Electrophoresis,2006,27(9):1853-1865.

[34]王海玲,池旭娟,闞雪芹,等.桑椹與葉片蛋白質(zhì)雙向電泳樣品制備方法的比較實驗[J].蠶業(yè)科學,2009,35(4):847-850.

[35]Isaacson T,Damasceno C M B,Saravanan R S.Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plan tissues[J].Nature Protocol,2006,1:769-774.