硫酸軟骨素的制備研究及發展現狀

,雅南, ,

(哈爾濱商業大學食品工程學院 黑龍江省高校食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076)

硫酸軟骨素(Chondroitin Sulfate,CS)是來自動物喉骨、鼻軟骨、氣管等富含軟骨組織的一類重要酸性高分子黏性多糖[1],具有多種重要生物活性。例如:具有抗炎、抗癌、抗HIV、降血脂、抗凝血活性的功效;能有效預防關節炎[2]、減輕打鼾;還可以改善食物風味、口感、光澤及保濕性[3-5]等。鑒于其潛在的醫藥價值,2010年《中華人民共和國藥典》將硫酸軟骨素列為防治心血管疾病和關節病的最佳藥物。同時硫酸軟骨素作為膳食補充劑和保濕劑,廣泛應用于食品和化妝品領域[6-7]。本文綜述了硫酸軟骨素的制備及提取純化工藝、檢測方法、性能研究,并闡述了近些年硫酸軟骨素在各領域的應用現狀,擬為硫酸軟骨素的進一步研究與開發奠定基礎。

1 硫酸軟骨素的制備工藝

1.1 硫酸軟骨素的提取制備方法研究現狀

硫酸軟骨素是由D-葡萄糖醛酸和氨基己糖交替連結而成的雙糖聚合物。它通常與蛋白質結合成糖蛋白的形式存在,當其水解時發生β-消去反應,使得連接硫酸軟骨素與蛋白質的O-糖苷鍵的糖-肽鍵斷裂,釋放出游離態的硫酸軟骨素,而O-糖苷鍵上連接的羥基氨基酸則分別轉化為相應的酮酸。

目前,國內外硫酸軟骨素的提取多來自豬軟骨[8]、豬喉骨[9]、雞胸軟骨[10];牛或羊鼻骨[11]、喉骨、軟肋、氣管、月牙骨以及各部位的雜軟骨[12];魚軟骨[13-15]、蛋殼膜[16]等。硫酸軟骨素主要利用動物提取法和發酵法進行提取制備。

1.1.1 動物提取法 動物提取法主要是堿提液醇沉工藝[17]、酶法提取工藝[18-19]、堿-酶提取法[8]、堿提-酶解-醇沉法[20]、反向沉淀法[21]、超聲波輔助法[22]、超聲波輔助-堿-雙酶-乙醇法[12]、氯化十六烷基吡啶沉淀法及有機溶劑沉淀法等,但制得的硫酸軟骨素均為粗品[23]。

高分子量的硫酸軟骨素,由于其表觀黏度高、結構復雜及細胞膜的選擇通透性等因素,造成了其生物利用率低、口服吸收差及療效不穩定。而低分子質量CS具有生物利用度高和活性強等功能特性,越來越受到人們的重視。徐崢嶸[24]等人以酸性粘多糖酶(透明質酸酶、硫酸軟骨素酶和肝素酶)裂解高分子量硫酸軟骨素,并用截留分子量為5000u的超濾膜將生成的低分子量硫酸軟骨素及時濾除,防止其進一步裂解,從而得到高產率的低分子量硫酸軟骨素。此方法克服了硫酸軟骨素酸水解工藝制備產品的分子量分布寬,產品得率低的缺點,可高效、大批量制備低分子量硫酸軟骨素,得率在80%以上。史敏娟[25]等人以過氧化氫+銅離子(Ⅱ)體系自由基法降解制備了低相對分子質量CS,結果表明:重均分子量從56596降到6906,己糖醛酸、氨基己糖及硫酸根等主要成分變化不大,差異不顯著,降解前后熱分解特性一致。此方法不會造成硫酸軟骨素主要成分的損失,具有較大的應用前景。

1.1.2 發酵法 硫酸軟骨素是動物軟骨中蛋白聚糖的主要成分,是具有少數幾種細菌的莢膜多糖。相比于動物提取法,微生物發酵法具有工藝條件溫和,原料豐富,無污染等優點,且產物提取率高,所含雜質少,已成為國內外研究的熱點。

微生物發酵法提取硫酸軟骨素采用的主要菌株有巴斯德桿菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌三種,它們都能利用以尿苷二磷酸(UDP)前體形式存在的單糖。劉立明[26]等人發明了一種產硫酸軟骨素菌株(枯草芽孢桿菌)的篩選方法,將菌種接種于營養肉湯培養基中,培養24h后離心收集發酵液,發酵液采用內標法經高效液相色譜進行定性分析,使得硫酸軟骨素標準品峰高增高的菌株即為產硫酸軟骨素的枯草芽抱桿菌。并用該菌株發酵法生產出硫酸軟骨素。

圍繞發酵法生產硫酸軟骨素這一研究主題,國內外研究人員已在高產微生物菌株篩選與改良[27-28]、發酵條件優化與控制、硫酸軟骨素合成機制與調控機理等方面開展了卓有成效的研究工作。為發酵法生產硫酸軟骨素的工業化奠定了基礎。

1.2 硫酸軟骨素的分離純化研究現狀

硫酸軟骨素的分離純化,多采用溶劑分級沉淀法[29]、季銨鹽法[14]、超濾膜法、色譜法、電泳法[30]、離子交換法[32]、超濾-離子層析法[33]等。

李燕妮[31]研究了超濾法分離提取雞胸軟骨中硫酸軟骨素和Ⅱ型膠原蛋白的工藝。確定超濾工藝為:雞胸軟骨水解液用截留分子量為10ku的超濾膜,在0.3MPa、10℃截留得到硫酸軟骨素,收率達97.1%;超濾透過液用截留分子量為3ku的超濾膜,在0.6MPa、10℃脫鹽濃縮,得到Ⅱ型膠原蛋白,收率達95.1%。

謝捷[32]等人研究應用離子交換法直接從豬鼻骨酶解液中分離純化豬硫酸軟骨素的工藝,并與傳統酶解-氧化法進行比較。研究表明:HZ-016型陽離子交換樹脂能從豬鼻骨酶解液中分離純化硫酸軟骨素,優化后的工藝條件:室溫25℃,上樣質量濃度20.5mg/mL,上樣流速1.0mL/min,最大上樣量1BV。離子交換法與傳統酶解-氧化法相比,收率提高6.5%,產品質量分數提高5.6%,雜蛋白含量降低28.6%。

陸釗[33]等采用超濾-離子層析法精制豬硫酸軟骨素,研究了超濾液溫度、超濾壓力、超濾液pH對豬硫酸軟骨素精制時膜通量和得率的影響。結果表明:超濾-離子層析技術可應用于精制豬硫酸軟骨素。豬硫酸軟骨素超濾的工藝條件:以微孔濾膜處理原料液,超濾膜的截留分子量10ku,超濾壓力0.25MPa,超濾溫度25℃,溶液pH為9。產物純度為95.74%,產率為80.15%。

相比于單一的超濾法或離子交換法來說,采用雙法聯合的超濾-離子層析法對硫酸軟骨素可達到精細提取的目的,且所得產物的產率和純度都較高,此法可應用于精制CS。

2 硫酸軟骨素的分析研究現狀

2.1 硫酸軟骨素的含量測定方法

隨著全球市場硫酸軟骨素需求量的增大,其在保健品和臨床中的應用越來越廣泛,不同的產品硫酸軟骨素含量不同,需要對產品進行含量鑒定,所以硫酸軟骨素含量測定方法不論在生產過程還是產品的質量控制過程中的作用都越來越重要。

研究硫酸軟骨素的測定方法主要有高效液相色譜法[34-35]、比濁法[36]、離子對反相高效液相色譜法[37]、分光光度法[38]、高效毛細管電泳法[39]、熒光定量分析法[40]、電化學法[41]、雙抗體夾心酶聯免疫吸附法[42]等。分子量的測定方面有分子排阻色譜(SEC)法,分子排阻色譜和多角度激光光散射聯用(SEC-MALLS)法[43]。不同方法有其自身的優缺點,在實際測定中應該根據實際條件和對結果的不同要求選擇不同的測定方法。

不同來源,不同生產工藝的硫酸軟骨素在含量和結構方面都不相同。目前2010年版《中國藥典》第二部針對硫酸軟骨素鈉(硫酸軟骨素鈉片和硫酸軟骨素鈉膠囊)含量測定的方法是通過計算酶解產生的軟骨素二糖、6-硫酸化的軟骨素二糖和4-硫酸化的軟骨素二糖的峰面積之和,計算出硫酸軟骨素鈉的含量[44]。而目前文獻報道的硫酸軟骨素的產率和純度差別很大,因此研究簡便、低價、快速、精確、安全、穩定、重復性好的測定方法依然是未來發展的趨勢。

2.2 硫酸軟骨素的結構驗證方法

陳士國[45]等人首次采用高溫核磁共振(1H NMR)對海參硫酸軟骨素結構進行初步鑒別,結果表明:高溫條件下海參硫酸軟骨素的1H NMR圖譜具有較好的分辨度。對其支鏈硫酸化巖藻糖的異頭氫進行歸屬和比較,并以此為指標鑒別不同種類海參硫酸軟骨素的結構差異,建立了一種以海參硫酸軟骨素結構特征為指標的海參指紋圖譜,為海參硫酸軟骨素的構效研究提供理論支持。

孫春艷[46]利用近紅外光譜儀對硫酸軟骨素采集圖譜后,建立相應的數學模型,為近紅外光譜鑒別其他性狀外觀相似的藥物奠定基礎。王靜[47]利用近紅外光譜分析技術快速無損定性鑒別硫酸軟骨素的來源。分別采用主成分分析法(sIMcA)、偏最小二乘判別分析法(PLS-DA)和支持向量機方法(SVM)三種模式識別方法建立硫酸軟骨素來源的判別模型,對驗證集樣品進行預測,研究結果表明:利用SVM方法建立數學模型,對硫酸軟骨素來源進行判別分析,模型的預測效果較好,達到了較高的準確度,可以作為企業的內控標準,為硫酸軟骨素進行溯源分析提供了新的途徑。

目前,質譜技術在寡糖序列分析中也得到了廣泛應用[48-49],但對于CS質譜細微結構分析,還主要采用酶解和多級質譜聯用技術,該技術不僅能確定IdoA、GlcA及其硫酸化位置,而且還能確定低硫酸化和多硫酸化寡糖的結構,為各種來源的CS結構分析提供可靠依據。Zaia等[50]用電噴霧四級桿飛行時間質譜和電噴霧離子井質譜串聯質譜法成功測定了CS二糖和寡糖中硫酸基的位置,并且區分了糖醛酸的差向異構體,得到了近乎完全的CS的結構信息。

3 硫酸軟骨素的功能性研究現狀

目前硫酸軟骨素的功能性研究主要集中在CS的體外抗氧化活性,硫酸軟骨素可通過抗氧化活性機制而具有抗纖維化活性,可以清除自由基和延緩衰老。徐瑞聰[51]研究了硫酸軟骨素對不同自由基的清除能力及硫酸軟骨素的還原能力,從而根據對各自由基的清除率和半抑制濃度來評價硫酸軟骨素的抗氧化能力。結果表明:硫酸軟骨素對超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基均有清除作用,并隨著濃度的增大,清除作用加強,證明了硫酸軟骨素具有一定的抗氧化活性。

同時CS為結締組織中天然存在的成分,能夠結合水分子用于潤滑和支撐關節,使關節活動自如,有效預防關節炎。CS可作為組織工程化關節軟骨天然的生物支架材料,在動物體內可被降解為氨基葡萄糖,參與代謝,表現出良好的生物相容性和生物可降解性。

此外,CS種類繁多,其功能不盡相同。例如:海參硫酸軟骨素對大鼠酒精性胃潰瘍具有保護作用[52],對小鼠腫瘤生長和轉移有抑制作用[53];從黃鱔中提取出的CS具有降血脂和降血糖的功效[54];鯊硫酸軟骨素具有抗炎癥和抗病毒的作用以及抗動脈硬化的功效。硫酸軟骨素-A對X射線造成的小鼠輻射損傷具有保護作用[55],尤其是在DNA損傷方面,為發掘天然抗輻射藥物提供新思路。

4 硫酸軟骨素的應用研究現狀

4.1 硫酸軟骨素在醫學方面的應用

硫酸軟骨素作為風濕病、關節炎[56-57]、肩周炎、腰痛、神經痛、偏頭痛等的治療藥物具有很好的效果,其機理為CS可直接補充軟骨的基質成分、減輕軟骨成分的降解、促進軟骨細胞的代謝、恢復軟骨細胞基質分泌功能、抑制關節內多種膠原酶的活性。

硫酸軟骨素還具有其他多種藥理活性,包括減少玻璃體與視網膜的粘連,保存角膜及治療角膜損傷,抗腫瘤,降解囊性纖維變性部位的黏液物,促進神經軸的再生以及增強軟骨細胞與軟骨的黏附力等,可用于新藥的開發。如軟骨組織工程的可注射殼聚糖/硫酸軟骨素復合水凝膠[58],抗急性炎癥氨基葡萄糖與CS復合片[59]的制備,骨修復材料[60]、滴眼液抑菌劑[61]等方面。

此外,硫酸軟骨素與銅等金屬離子結合可用于治療皮膚病,與硝酸鉍或氫氧化鋁反應得到的絡合物可用于治療消化性潰瘍,與苯甲酸酯、利多卡因或布比卡因作用生成的衍生物可用作麻醉劑。

4.2 硫酸軟骨素在其他方面的應用

近些年,硫酸軟骨素還應用在食品及保健食品領域中,被用作食品添加劑[47]。加到肉制品中,對于增強其持水性、保持肉的柔嫩性、掩蓋異味、防止褐變等方面起了很大的作用。美國藥典-處方集將硫酸軟骨素列為膳食補充劑,CS與其它物質(如苯丙氨酸、VB3、VB5、VB6等)調配可制成止痛膳食。此外,硫酸軟骨素鈉鹽還能消除魚臭,保護膠質性強,而且在蛋黃醬中添加后,可改善風味、口感及制品的光澤。

硫酸軟骨素含有大量的羧基和硫酸基,它們以多聚陰離子的形式存在,具有保水性、保膠性和高粘性,可與某些物質調制成化妝品,具有強化結締組織、擴張末端血管、促進營養吸收和廢物排除、改善皮膚細胞代謝和保持皮膚水分等作用。

5 硫酸軟骨素的發展前景

5.1 存在的不足

全世界硫酸軟骨素產業主要集中于我國,約占據全球產量的80%,是CS最大生產國和出口國。2010年上半年,我國CS出口量為1962t,出口額達1.3億美元。全國以山東省為最主要的生產出口省份,每年出口金額達到2億美元。我國目前已有一些醫藥企業擁有CS原料藥生產的批準文號,這些企業都以收購CS粗提物和半成品為主,作為其藥物、食品添加劑原料和中間體,進一步純化為藥品、食品及化妝品添加劑,因此,對粗提物和半成品有廣泛需求。

盡管我國硫酸軟骨素產業發展強勁,但仍然面臨原料生產周期長(動物軟骨的生產周期較長)、分布很分散,收集、儲存、運輸困難,很難實現集中大規模的收購,產業水平不高(工藝繁瑣、收率不高、質量不穩)、產品質量缺陷(采用γ射線殺菌導致輻射殘留)、污染嚴重(產生大量的有機物和蛋白廢水)等制約產業發展的關鍵瓶頸[62]。因此,如何發展原料豐富、技術先進、質量優異、清潔環保的生產工藝是促進CS產業發展的關鍵。

5.2 展望

綜上所述,硫酸軟骨素的研究仍有廣闊的前景和發展空間。開發來源豐富,價格低廉的CS資源,解決原料問題;在生產工藝上,力圖研究出與目前國內加工水平相適應的生產工藝,降低生產成本;分析技術上建立相應質量監測體系;硫酸軟骨素不同組分的分離技術;在活性研究的基礎上重視擴展其在功能食品、保健品等領域的應用都將是硫酸軟骨素研發重點。

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