全基因組擴增技術原理及研究進展

潘孝明 梁興國

（中國海洋大學食品科學與工程學院，青島 266003）

全基因組擴增技術原理及研究進展

潘孝明 梁興國

（中國海洋大學食品科學與工程學院，青島 266003）

DNA芯片及下一代測序等高通量技術的發展極大促進了分子生物學技術在各領域的廣泛應用，但此時樣品數量與質量往往是制約研究進行的重要因素，全基因組擴增技術（Whole genome amplification, WGA）則可有效解決這一問題，其可使極微量目標基因組DNA同時得到擴增從而提供滿足高通量分析研究所需的起始材料。高效可靠的全基因組擴增技術使基于單細胞水平的大規模全基因組分析成為現實，且隨著研究的不斷深入，對全基因組擴增技術提出了更高的要求。對過去常用的以及近期發展的全基因組擴增技術進行了概述，闡明了各種方法的原理，并對各種方法的特點從原理上進行了分析總結，以期為全基因組擴增技術的應用提供一定的參考。

全基因組擴增 單細胞基因組測序 基因型 基因組變異 突變檢測

現代分子生物學的不斷發展除了為生物學領域帶來了革命性的突破之外，也被廣泛應用于其他相關領域，極大地推動了諸如食品、醫學、環境等學科的研究，成為各學科前沿研究中必備的強大工具。分子生物學方法大多是以DNA作為最主要的研究對象，而很多情況下可供分析使用的DNA數量極少，如胚胎植入前遺傳學診斷（Preimplantation genetic diagnosis，PGD）可有效避免植入胚胎存在某些疾病而具有顯著的優生學意義，而這一技術的實現僅僅允許使用1-2個胚胎細胞進行分析檢測［1］；在法醫鑒定中往往僅能獲得痕量DNA樣品等［2］，此時下一代測序（Next generation sequencing，NGS）與DNA芯片技術等高通量分析方法往往受限于樣品量太少而無法發揮其作用［3］，全基因組擴增技術（Whole genome amplification，WGA）能夠實現對整個基因組的擴增以提供大量可供分析樣品，因而為此類研究提供了強有力的支持，并且高靈敏度WGA技術的不斷進步也極大促進了單細胞全基因組測序技術的

發展，使很多針對單細胞的大規模研究分析成為了可能，在疾病早期診斷、微衛星序列分析、雜合子丟失（Loss of heterozygosity，LOH）、突變檢測以及生物進化研究中具有重要的意義。近年來應用WGA技術的單細胞分析日臻成熟且取得了顯著成果［4-8］，本文將對目前已經廣泛應用的以及新出現的WGA方法從原理、應用等方面進行介紹，并對各自方法的優點以及存在的問題進行概括性總結。

1 基于PCR技術的WGA方法

1.1 引物延伸預擴增法

在所有WGA方法中引物延伸預擴增法（Primerextension preamplification，PEP）是較早出現的一種，Zhang等［9］最早應用PEP方法實現了單個單倍體細胞基因組的全擴增。PEP法是一種基于PCR技術發展而來的WGA方法，主要原理是使用15個堿基長的隨機引物（N15，理論上有415種組合）在37℃的低退火溫度下進行較長時間的退火，然后緩慢升溫至55oC進行長時間的引物延伸，如此反復多個循環（圖1）。Dietmaier等［10］對PEP方法進行了一定的改進，包括對模板DNA的提取方法、反應循環條件的優化以及高保真聚合酶的使用等，并成功實現同時對單個腫瘤細胞的多個突變位點進行分析［10，11］；Anchordoquy等［12］通過PEP法對口腔細胞基因組全擴增后進行基因型分析，對多達1 890例等位基因的分析結果表明PEP法可提供足量優質的模板滿足高通量基因型分析的要求。但由于PEP法使用隨機引物以及較為不嚴格的PCR循環參數，因此可能導致不均衡的擴增結果產生［13，14］。

圖1 引物延伸預擴增法原理示意圖［9］

1.2 簡并寡核苷酸引物PCR

與PEP法類似，簡并寡核苷酸引物PCR法（Degenerate oligonucleotide primed PCR，DOP-PCR）也是一種基于PCR技術的全擴增方法（圖2），最早由Telenius等［15］提出，其原理是使用部分簡并的引物進行PCR反應（引物中間部分含有6個隨機堿基），在最初的幾個循環過程中使用較低的溫度（～25℃）進行退火以確保引物與模板的結合，并緩慢升溫至引物延伸溫度進行引物延伸，完成最初幾個循環后使用相對較高的退火溫度（～55℃）進行多循環常規PCR反應，對DOP-PCR結果影響較大的是因素是聚合酶及引物濃度，因此需要進行優化以獲得最佳實驗結果［15，16］。Cheung等［17］應用DOP-PCR對不足1 ng的人類基因組DNA實現了數百倍的擴增，并提供滿足上百次微衛星序列基因型分析所需的模板；Van等［18］對傳統DOP-PCR進行了一定改進，同時使用4條簡并引物進行擴增，且每條引物中間都含有8個隨機堿基，從而增加了引物的簡并性，并將DOP-PCR產物使用Roche GS-FLX平臺進行下一代測序（NGS）從而實現了對研究較少的大豆品種（Sinpaldalkong 2）的基因組結構分析，表明DOPPCR法在對未知樣品分析中具有一定潛力。DOPPCR法雖然使用相對PEP法更為嚴格的PCR反應條件，但引物與模板間結合的不確定性以及引物間的相互作用仍可能導致較低的全擴增靈敏度及較高的錯誤率［19］。因此，較大程度上限制了該方法的應用，近年來應用該方法的報道相對較少。

圖2 簡并寡核苷酸引物PCR原理示意圖［15］

1.3 連接介導PCR

廣義上連接介導PCR（ligation-mediated PCR，LM-PCR）指的是一類有接頭連接過程參與的PCR反應，相對于PEP與DOP-PCR，連接介導PCR最初并非設計用來進行基因組全擴增，其最早是由Pfeifer等應用于體內足跡研究（in vivo footprinting）、甲基化分析、DNA損傷鑒定等［20-23］，在此基礎上對其稍加改變即可進行基因組全擴增反應［4，24］。總體而言LM-PCR全擴增技術需要通過3個步驟來實現：（1）模板DNA的片段化處理：可通過物理剪切或限制性內切酶處理使基因組DNA斷裂成若干適合PCR擴增的片段。使用物理剪切法對DNA進行處理時因無法預測片段末端結構，因此需要對其進行平末端化處理以滿足其與接頭進行連接的條件［25］，如使用限制性內切酶對模板進行剪切，因各片段末端組成已知，因此大多數情況下無需對片段進行處理［26］；（2）模板片段與接頭連接：根據酶切片段類型設計可與之連接的接頭，在DNA連接酶的作用下與模板片段兩端連接，接頭中含有一段外源通用引物序列，用作下一步PCR反應中的引物；（3）全擴增PCR反應：連接成功的模板片段經引物延伸后兩端形成了通用引物結合位點，因此可以外源引入的通用引物進行PCR反應，包括接頭在內的模板片段可同時得到擴增（圖3）。

圖3 連接介導PCR原理示意圖

對基因組的片段化處理是LM-PCR全擴增技術的關鍵步驟之一，其對接下來的連接反應及PCR反應具有較大影響，使用物理剪切法可較好保證片段長度的均一性，但需要進行片段平末端化處理。Tanabe等［27］在傳統LM-PCR的基礎上發展了PRSG法（Adaptor-ligation PCR of randomly sheared genomic DNA）對基因組進行全擴增，其使用HydroShear儀將基因組DNA隨機剪切成0.5-2 kb的片段進行接頭連接后擴增，通過對307個微衛星序列進行基因分型以及287個基因座進行CGH分析的結果表明PRSG法可準確高效的實現全基因組擴增。酶法剪切無需昂貴的儀器因此可在絕大多數實驗室進行，但使用限制性內切酶對基因組進行酶切時無法預測其片段長度，尤其是無法完全避免較長片段的產生，針對這一問題Liu等［28］采用3種內切酶（DpnII，HhaI，RsaI）對基因組進行酶切，通過對石蠟包埋的腫瘤組織的全擴增結果表明LM-PCR全擴增覆蓋率可達到96%，進一步將產物應用于CGH以及PCR-SSCP分析（PCR-single-strand conformation polymorphism）驗證了其擴增產物的準確性，說明LM-PCR全擴增方法在對保存狀況較差樣品的分析方面具有巨大的潛力。相對于其他基于PCR技術的全擴增方法（如上述的PEP與DOP-PCR），LM-PCR法使用較為嚴格的擴增條件，且使用的是一條通用引物，所有連接片段間與通用引物結合的能力相同，因此可在很大程度上保證所有片段得到相同程度的高靈敏度擴增。目前已有Sigma公司應用該技術開發的GenomePlex系列試劑盒產品［4，24，29］。LM-PCR方法的優點是擴增效率極高，缺點是步驟相對繁瑣，對復雜DNA序列（如富含GC結構的模板）的擴增可能出現偏差，并且由于模板片段間具有相同的黏性末端（或平末端），因此在接頭連接過程中這些片段間會不可避免的發生“無序自連”，導致重組得到的片段較長而擴增失敗。針對這一“自連”問題，作者所在課題組使用IIS型限制性內切酶對基因組進行酶切產生具有隨機堿基黏性末端的片段，配合使用具有隨機堿基黏性末端的接頭，可極大減少自連現象發生的幾率。以BbvI內切酶為例（識別位點GCAGC（8/12）↓），其可產生具有4堿基隨機堿基的黏性末端NNNN，因此可將自連概率減少44=256

倍，并通過qPCR等技術驗證了這一改良方法極高的擴增效率，各目標片段可較為均衡的擴增數百萬倍［30］。

2 恒溫全基因組擴增反應

2.1 多重置換擴增反應

基于恒溫核酸擴增技術的多重置換擴增法（Multiple displacement amplification，MDA）的出現相對PCR類全擴增方法較晚，其基本原理是使用一條硫代修飾的六核苷酸隨機引物（N6）在恒溫條件下與基因組隨機退火，并在具有強鏈置換活性的phi29 DNA聚合酶的作用下發生鏈置換擴增反應，置換產生的單鏈序列又可與隨機引物任意退火延伸，形成超分支擴增結構［31］，由于phi29 DNA聚合酶具有較強的持續合成DNA的能力，因此可持續合成長達50-100 kb的產物（圖4）。Dean等［32］最早應用MDA法進行全基因組擴增，相對于PCR類方法，MDA法顯示出極高的擴增靈敏度（1-10基因組拷貝），且通過對8個染色體位點的擴增檢測結果顯示各目標間擴增偏差可控制在3倍以內，遠遠小于DOP-PCR等方法4-6個數量級的擴增偏差。此后，有大量成功應用MDA法進行WGA的報道，如Hellani等［33］將MDA法成功應用于PGD研究；Kumar等［34］應用MDA法實現了對難于培養的伯納特氏立克次氏體基因組的全擴增等，均顯示出其極高的WGA效率。但其對模板質量的要求相對較高，在非最佳實驗條件下亦可導致非均衡擴增的產生［35］。由于MDA法是一種恒溫核酸擴增方法，可能存在一定的非特異性擴增問題，即體系內不含有模板時也會產生大量產物，針對這一問題Marcy等［36］使用極微量的MDA體系（60 μL）對單細胞基因組DNA進行全擴增；Pan等［37］通過向體系中加入一種特殊的海藻糖進行MDA反應，均對非特異性擴增產生了一定的抑制效果。

MDA法是目前公認應用最廣泛的WGA方法，操作簡單且對實驗儀器的要求極低，且使用非預變性的模板時也可取得良好的WGA效果，可進一步簡化實驗操作及避免污染的產生［32］，可廣泛應用于基因組測序、CGH、SNPs分析等相關領域，目前針對該方法開發的產品較為成熟，具有代表性的為Qiagen公司的Repli-g系列全擴增試劑盒［38-40］。

圖4 多重鏈置換法全擴增原理示意圖［31］

2.2 基于引物酶的全基因組擴增

由T7細菌噬菌體核酸復制方式演化而來的基于引物酶的全基因組擴增（Primer-based whole genome amplification，pWGA）是一種恒溫全基因組擴增方法，相對于其他所有WGA方法，pWGA最大的特點是在擴增過程中不需要使用任何引物，且其不需要對模板進行預變性處理［41］。pWGA過程中所需的T7 gp4蛋白可同時發揮解旋酶和引物酶的作用，該蛋白的C端部分可利用脫氧胸苷三磷酸（dTTP）水解產生的能量來將DNA雙鏈解旋；而N端則行使引物酶（primase）的作用，其特異性識別3'-CTGG（G/T）-5'和3'-CTGTG-5'并產生短的RNA作為擴增引物。引物生成后在T7 DNA聚合酶全酶的作用下進行持續的擴增反應，由T7 gp2.5基因編碼的單鏈DNA結合蛋白（Single-stranded DNA binding protein）與解旋產生的單鏈DNA結合并與解旋酶/引物酶、聚合酶一起完成整個全基因組擴增過程（圖5），該擴增模式與滾環擴增（Rolling circle amplification，RCA）相似并可以產生長達40 kb的產物［42］。

圖5 基于引物酶全基因組擴增法原理示意圖［42］

除上述幾種蛋白（酶）外，pWGA反應還需要核苷二磷酸激酶（Nucleoside diphosphokinase）、無機焦磷酸酶（Inorganic pyrophosphatase）以及由肌酸激酶（Creatine kinase）和磷酸肌酸（Phosphocreatine）組成的ATP生成系統。其中核苷二磷酸激酶的主要作用是將NTPs中的γ-磷酸基團轉移至NDPs以重新形成NTPs而平衡體系中的dNDP與dNTP的比例，并可以從一定程度上彌補解旋過程中造成的dTTP損失；無機焦磷酸酶可以將擴增反應中產生的無機焦磷酸分解為磷酸鹽，減少因其累積而對T7 DNA聚合酶造成的抑制；最終肌酸激酶將磷酸肌酸中的高能磷酸鍵轉移至dNTPs，從而合成新的dNTPs而提高全擴增的效率。

與MDA法相比，pWGA法僅需1 h即可完成反應。Schaerli等［43］發展了使用T4噬菌體gp61引物酶的全擴增體系T4 pWGA，并顯示出在基因組測序、DNA標記、大規模菌落篩選以及DNA定量等方面的潛力，但相對于其他WGA方法，目前對pWGA法的報道仍偏少［2］，除該方法面世不久之外，反應需要較多的蛋白（酶）、試劑組合也可能對其推廣普及產生一定的限制作用。

3 多次退火環狀循環擴增技術

美國國家科學院院士謝曉亮教授帶領的團隊于2012年底在Science雜志上連續發表了兩篇應用其新發明的一種WGA方法進行單細胞測序研究的文章，引出了“多次退火環狀循環擴增技術”（Multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC）這一全新的WGA方法，并應用該方法成功實現了單細胞水平的單核苷酸變異（Singlenucleotide variations，SNVs）以及拷貝數變異（Copynumber variations，CNVs）的研究［44，45］。其結合了MDA法與PCR方法的特點，使用的35 nt長的引物由一段固定的27 nt通用引物序列和8 nt隨機堿基序列（N8）組成，在0oC時該8 nt隨機堿基序列可與模板任意退火，梯度升溫至65oC后在具有鏈置換活性的Bst大片段DNA聚合酶作用下發生鏈置換聚合反應，得到一系列長度不一的（0.5-1.5 kb）半擴增子（Semiamplicons），在94℃變性、0℃退火以及65℃延伸循環后，上一循環中半擴增子形成了兩端具有互補結構（27 nt）的全擴增子（Amplicons），隨后降低溫度至58℃使得到的擴增子兩端互補形成loop結構，從而可以避免引物與其進行結合導致全擴增子倍增導致的不均衡擴增，因此可以很大程度上保證該循環發生的是線性擴增。在經過5個上述類似線性擴增循環后可得到大量全擴增子并做為接下來PCR反應的模板，并使用該27 nt通用引物進行指數PCR反應，因此只有全擴增子才能得到有效擴增，從而實現對整個基因組的高效而又均衡的全擴增（圖6）。

圖6 多次退火環狀循環擴增技術原理示意圖［44］

MALBAC法顯示出比MDA法更為均衡的擴增結果［44］，但使用單細胞進行基因型分析時MALBAC法的假陽性率偏高，比MDA可高出40倍，這可能是因為MDA法使用的phi29 DNA聚合酶比MALBAC法應用的Bst和Taq聚合酶具有更高的保真度，因此往往需要使用多個細胞以獲得更加準確的結果［46］。由于MALBAC法對單細胞全基因組擴增具有很高的覆蓋率（93%）和均衡性，甫一出現就引起了較多的關注，Ni等［47］成功應用其對外周血液中極少數的循環腫瘤細胞（CTCs）進行CNVs分析，Hou等［48］對單個卵母細胞進行基因組測序，顯示出該方法在癌癥早期檢測以及胚胎移植等領域的廣闊應用前景。

4 結語

綜上所述，單細胞基因組測序技術的發展極大促進了癌癥、基因組變異等眾多領域研究進展，而

決定這一技術應用成功與否的最關鍵因素就是全基因組擴增效果，因此對現有WGA方法進行改良或研發新的高效WGA方法是目前研究的熱點［46，49-51］。總體而言現有WGA方法各有特點（表1），需根據實際情況選擇合適的WGA方法加以應用。如PCR類全擴增方法對樣品質量要求相對較低且擴增效率高，但全擴增產物片段較短，指數反應易導致所有片段的非均衡擴增；而MDA法的成功應用的前提是高質量基因組模板的獲得，其擴增產物較為均衡且更加利于全基因組測序；但無論PCR類方法或是恒溫全擴增方法，目前都存在一定的非特異性擴增現象，即使在較為嚴格的PCR反應條件下這一問題仍無法完全避免［52，53］，因此對現有方法加以改進抑制非特異性擴增也是當前WGA方法研究中需要解決的問題，如數字微滴PCR（Digital microdroplet PCR）的發展可為基于PCR技術的WGA方法帶來一些新的思路。

表1 主要的WGA方法比較

目前已有上千種生物基因組被測序，但是相對于更多的其他物種，已測序的物種數量僅占極少數［54］，如自然界中絕大多數微生物不可培養且難以富集，導致針對這類微生物的全基因組測序難度極大［55，56］。因此，高效而又可靠的WGA技術將在更多相關研究領域中大有可為。

［1］Harper JC, Sengupta SB. Preimplantation genetic diagnosis：state of the art 2011［J］. Human Genetics, 2012, 131（2）：175-186.

［2］蔡海強, 柳海濤, 史斌, 等. 全基因組擴增技術及其在法醫個體識別中的應用［J］.遺傳, 2010, 32（11）：1119-1125.

［3］潘星華, 朱海英, Marjani SL. 單細胞基因組學分析的技術前沿［J］.遺傳, 2011, 33（1）：17-24.

［4］Lasken RS, Egholm M. Whole genome amplification：abundant supplies of DNA from precious samples or clinical specimens［J］. Trends in Biotechnology, 2003, 21（12）：531-535.

［5］Hawkins TL, Detter JC, Richardson PM. Whole genome amplification-applications and advances［J］. Current Opinion in Biotechnology, 2002, 13（1）：65-67.

［6］Hasmats J, Green H, Orear C, et al. Assessment of whole genome amplification for sequence capture and massively parallel sequencing［J］. PloS One, 2014, 9（1）：e84785.

［7］Kumar S, Gangoliya SR, Berri M, et al. Whole genome amplification of the obligate intracellular pathogen coxiella burnetii using multiple displacement amplification［J］. Journal of Microbiological Methods, 2013, 95（2013）：368-372.

［8］Maciejewska A, Jakubowska J, Pawlowski R. Whole genome amplification of degraded and nondegraded DNA for forensic purposes［J］. International Journal of Legal Medicine, 2013, 127（2）：309-319.

［9］Zhang L, Cui X, Schmitt K, et al. Whole genome amplification from a single cell-implications for genetic analysis［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 1992, 89：5847-5851.

［10］Dietmaier W, Hartmann A, Wallinger S, et al. Multiple mutation analyses in single tumor cells with improved whole genome amplification［J］. Am J Pathol, 1999, 154（1）：83-95.

［11］Arneson N, Hughes S, Houlston R, et al. Whole-genome amplification by improved primer extension preamplification PCR（I-PEPPCR）［J］. CSH Protoc, 2008：pdb prot4921.

［12］Anchordoquy HC, McGeary C, Liu L, et al. Genotyping of three candidate genes after whole-genome preamplification of DNA collected from buccal cells［J］. Behavior Genetics, 2003, 33（1）：73-78.

［13］Hanson EK, Ballantyne J. Whole genome amplification strategy for forensic genetic analysis using single or few cell equivalents of genomic DNA［J］. Analytical Biochemistry, 2005, 346（2）：246-257.

［14］Pinard R, DeWinter A, Sarkis, GJ, et al. Assessment of whole genome amplification-induced bias through high-throughput, massively parallel whole genome sequencing［J］. BMC Genomics, 2006, 7：216.

［15］Telenius H, Carter NP, Bebb CE, et al. Degenerate oligonucleotideprimed PCR：general amplification of target DNA by a single degenerate primer［J］. Genomics, 1992, 13（3）：718-725.

［16］Huang Q, Schantz SP, Rao PH, et al. Improving degenerate oligonucleotide primed PCR-comparative genomic hybridization for analysis of DNA copy number changes in tumors［J］. Genes Chromosomes & Cancer, 2000, 28（4）：395-403.

［17］Cheung VG, Nelson SF. Whole genome amplification using a degenerate oligonucleotide primer allows hundreds of genotypes to be performed on less than one nanogram of genomic DNA［J］. Proc Nat Acad Sci USA, 1996, 93（25）：14676-14679.

［18］Van K, Kang YJ, Shim SR, et al. Genome-wide scan of the soybean genome using degenerate oligonucleotide primed PCR：an example for studying large complex genome structure［J］. Genes & Genomics, 2012, 34（5）：467-474.

［19］Lee CI, Leong SH, Png AE, et al. An isothermal method for whole genome amplification of fresh and degraded DNA for comparative genomic hybridization, genotyping and mutation detection［J］. DNA Research, 2006, 13（2）：77-88.

［20］Pfeifer GP, Steigerwald SD, Mueller PR, et al. Genomic sequencing and methylation analysis by ligation mediated PCR［J］. Science, 1989, 246（4931）：810-813.

［21］Dai SM, Chen HH, Chang C, et al. Ligation-mediated PCR for quantitative in vivo footprinting［J］. Nature Biotechnology, 2000, 18（10）：1108-1111.

［22］Hornstra IK, Yang TP. In vivo footprinting and genomic sequencing by ligation-mediated PCR［J］. Analytical Biochemistry, 1993, 213（2）：179-193.

［23］Quivy JP, Becker PB. An improved protocol for genomic sequencing and footprinting by ligation-mediated PCR［J］. Nucleic Acids Research, 1993, 21（11）：2779-2781.

［24］Klein CA, Schmidt-Kittler O, Schardt JA, et al. Comparative genomic hybridization, loss of heterozygosity, and DNA sequence analysis of single cells［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96（8）：4494-4499.

［25］Arneson N, Hughes S, Houlston R, et al. Whole-genome amplification by adaptor-ligation PCR of randomly sheared genomic DNA（PRSG）［J］. Cold Spring Harbor Protocols, 2008：pdb prot4922.

［26］Brugman MH, Suerth JD, Rothe M, et al. Evaluating a ligationmediated PCR and pyrosequencing method for the detection of clonal contribution in polyclonal retrovirally transduced samples［J］. Human Gene Therapy Methods, 2013, 24（2）：68-79.

［27］Tanabe C, Aoyagi K, Sakiyama T, et al. Evaluation of a wholegenome amplification method based on adaptor-ligation PCR of randomly sheared genomic DNA［J］. Genes Chromosomes & Cancer, 2003, 38（2）：168-176.

［28］Liu D, Liu C, DeVries S, et al. LM-PCR permits highly representative whole genome amplification of DNA isolated from small number of cells and paraffin-embedded tumor tissue sections［J］. Diagnostic Molecular Pathology, 2004, 13（2）：105-115.

［29］Brueck C, Song S, Collins J. Oligonucleotide array CGH analysis of a robust whole genome amplification method［J］. Biotechniques, 2007, 42（2）：230-233.

［30］Pan X, Wan B, Li C, et al. A novel whole genome amplification method using type IIS restriction enzymes to create overhangs with random sequences［J］. Journal of Biotechnology, 2014, 184：1-6.

［31］Hosono S, Faruqi AF, Dean FB, et al. Unbiased whole-genome amplification directly from clinical samples［J］. Genome Research, 2003, 13（5）：954-964.

［32］Dean FB, Hosono S, Fang L, et al. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 2002, 99（8）：5261-5266.

［33］Hellani AM, Akoum SM, Fadel ES, et al. Successful pregnancies after combined human leukocyte antigen direct genotyping and preimplantation genetic diagnosis utilizing multiple displacement amplification［J］. Saudi Medical Journal, 2012, 33（10）：1059-1064.

［34］Kumar S, Gangoliya SR, Berri M, et al. Whole genome amplification of the obligate intracellular pathogen coxiella burnetii using multiple displacement amplification［J］. Journal of Microbiological Methods, 2013.

［35］Yilmaz S, Allgaier M, Hugenholtz P. Multiple displacement amplification compromises quantitative analysis of metagenomes［J］. Nature Methods, 2010, 7（12）：943-944.

［36］Marcy Y, Ishoey T, Lasken RS, et al. Nanoliter reactors improve multiple displacement amplification of genomes from single cells［J］. PLoS Genetics, 2007, 3（9）：1702-1708.

［37］Pan X, Urban AE, Palejev D, et al. A procedure for highly specific, sensitive, and unbiased whole-genome amplification［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 2008, 105（40）：15499-15504.

［38］Fernandez-Ortuno D, Tores JA, DeVicente A, et al. Multiple displacement amplification, a powerful tool for molecular genetic analysis of powdery mildew fungi［J］. Current Genetics, 2007, 51（3）：209-219.

［39］Dickson PA, Montgomery GW, Henders A, et al. Evaluation of multiple displacement amplification in a 5 cm STR genome-wide scan［J］. Nucleic Acids Research, 2005, 33（13）：e119.

［40］Ellegaard KM, Klasson L, Andersson SG. Testing the reproducibility of multiple displacement amplification on genomes of clonal endosymbiont populations［J］. PloS One, 2013, 8（11）：e82319.

［41］Kim J, Easley CJ. Isothermal DNA amplification in bioanalysis：strategies and applications［J］. Bioanalysis, 2011, 3（2）：227-239.

［42］Li Y, Kim HJ, Zheng C, et al. Primase-based whole genome amplification［J］. Nucleic Acids Research, 2008, 36（13）：e79.

［43］Schaerli Y, Stein V, Spiering MM, et al. Isothermal DNA amplification using the T4 replisome：circular nicking endonuclease-dependent amplification and primase-based whole-genome amplification［J］. Nucleic Acids Research, 2010, 38（22）：e201.

［44］Zong C, Lu S, Chapman AR, et al. Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell［J］. Science, 2012, 338（6114）：1622-1626.

［45］Lu S, Zong C, Fan W, et al. Probing meiotic recombination and aneuploidy of single sperm cells by whole-genome sequencing［J］. Science, 2012, 338（6114）：1627-1630.

［46］Lasken RS. Single-cell sequencing in its prime［J］. Nature Biotechnology, 2013, 31（3）：211-212.

［47］Ni XH, Zhuo ML, Su Z, et al. Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 2013, 110（52）：21083-21088.

［48］Hou Y, Fan W, Yan L, et al. Genome analyses of single human oocytes［J］. Cell, 2013, 155（7）：1492-1506.

［49］Caldas C. Cancer sequencing unravels clonal evolution［J］. Nature Biotechnology, 2012, 30（5）：408-410.

［50］Evrony GD, Cai X, Lee E, et al. Single-neuron sequencing analysis of L1 retrotransposition and somatic mutation in the human brain［J］. Cell, 2012, 151（3）：483-496.

［51］Junker JP, van Oudenaarden A. Every cell is special：genomewide studies add a new dimension to single-cell biology［J］. Cell, 2014, 157（1）：8-11.

［52］Kato T, Liang X, Asanuma H. Model of elongation of short DNA sequence by thermophilic DNA polymerase under isothermal conditions［J］. Biochemistry, 2012, 51（40）：7846-7853.

［53］王陽, 賈蕾敏, 董平, 等. 三核苷酸雙鏈重復序列擴展合成特性及其機理［J］. 生物化學與生物物理進展, 2013, 40（4）：345-355.

［54］彭伶俐, 王琴, 辛明秀. 自然界中不可培養微生物的研究進展［J］. 微生物學雜志, 2011, 31（2）：75-79.

［55］Zhang K, Martiny AC, Reppas NB, et al. Sequencing genomes from single cells by polymerase cloning［J］. Nature Biotechnology, 2006, 24（6）：680-686.

［56］Kalisky T, Quake SR. Single-cell genomics［J］. Nature Methods, 2011, 8（4）：311-314.

（責任編輯 狄艷紅）

Principle of Whole Genome Amplification Technology and Its Progress

Pan Xiaoming Liang Xingguo
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003）

The rapid developments of DNA array and next generation sequencing technologies had greatly promoted molecular biology techniques to be used in various fields. However, the limited quantity and quality of sample DNA may affect large scale genetic analyses. To overcome these problems, the whole genome amplification（WGA）technology was employed to amplify trace amounts of genomic DNA to sufficient quantity to meet the requirements of high throughput analyses. The highly efficient and reliable WGA methods also helped to realize large scale of genetic analyses based on even single cell. Moreover, as the single cell level research continues, more efficient WGA approaches were developed. This paper summarized the general WGA methods frequently used before and newly developed methods on basic principle level as well as the advantages and disadvantages of each method, which helped to make good use of the powerful WGA techniques.

Whole genome amplification Single cell sequencing Genotyping Genome variations Mutation detection

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.008

2014-04-10

國家青年千人計劃，山東省萬人計劃，山東省自然科學杰出青年基金（JQ201204）

潘孝明，男，博士研究生，研究方向：食品分子生物學；E-mail：pan.xiao.ming@163.com

梁興國，男，教授，研究方向：核酸化學與生物技術；E-mail：liangxg@ouc.edu.cn