應用深度測序技術鑒定平菇球形病毒

王少杰王廿師迎春胡曉艷周濤

（1.中國農業大學植物病理學系，北京 100193；2.北京市植物保護站，北京 100029；3.北京市農業技術推廣站，北京 100029）

應用深度測序技術鑒定平菇球形病毒

王少杰1王廿1師迎春2胡曉艷3周濤1

（1.中國農業大學植物病理學系，北京 100193；2.北京市植物保護站，北京 100029；3.北京市農業技術推廣站，北京 100029）

旨在鑒定采集于北京順義的畸形平菇樣品中的病毒，提取總RNA，構建小RNA庫，對小RNA庫進行深度測序。測序結果表明，與平菇球形病毒（Oyster mushroom isometric virus，OMSV）基因組序列（NC_004560.1）匹配的小RNA共有3 075條，分布在OMSV基因組的不同位置，形成一些熱點區域。經拼接，獲得了3條長度大于500個核苷酸的序列。根據其中覆蓋OMSV外殼蛋白（Coat protein，CP）基因的序列（seq22）中相對保守區域，設計引物，利用RT-PCR擴增獲得cp基因部分序列。序列比對表明，其與OMSV相應區域序列相似度為91%，證實了OMSV在畸形平菇樣品中的侵染。同時，將深度測序結果與現有4種siRNA預測軟件的預測結果進行比較，發現測序結果與軟件預測結果之間存在差異，討論了這一差異出現的原因。

平菇 深度測序 平菇球形病毒 小干擾RNA 重疊群

平菇（Pleurotus ostreatus），又名糙皮側耳，是我國中原地區種植量最大的食用菌之一［1］。在平菇菌種繁育、種植過程中會受到一些病毒侵染為害，導致平菇子實體畸形，嚴重時造成不發菇，導致產量和品質下降［2］。目前，對食用菌等真菌中病毒的檢測、鑒定、新病毒的發現等通常采用提取雙鏈RNA（double strand RNA，dsRNA）的方法，該方法所需樣品多，過程復雜，需經反復試驗和優化才能獲得高質量的dsRNA用于序列測定，限制了相關領域的研究。

深度測序技術鑒定病毒是近幾年快速發展起來的一項技術［3］。運用深度測序技術鑒定病毒的理論

基礎是RNA干擾機制。20世紀末，研究人員發現生物體內某些RNA分子能夠通過某一特定機制降低相應基因的表達水平，這一特定機制為RNA干擾機制［4］。RNA干擾作為寄主的一種防御機制，廣泛地參與到寄主對抗各種病原物侵染的過程中。在寄主與病毒的互作中，病毒復制過程中產生的dsRNA被寄主的某些特殊的內切核糖核酸酶切割成小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），這些siRNA引導寄主體內AGRONAUTE蛋白沉默與上述siRNA序列互補的病毒RNA［5］。參與沉默病毒RNA的這種siRNA被稱為病毒衍生的小干擾RNA（virusderived small interfering RNA，vsiRNA），vsiRNA之間在序列上有重疊，因此可以被組裝成連續的片段，這些連續的片段與相應病毒的序列相同或者相似［6，7］。將vsiRNA的上述特性與深度測序技術相結合后，即可應用深度測序技術鑒定已知病毒及某些新病毒了［8-10］。這一鑒定病毒的方法適用于多種生物體內多種病毒的鑒定［8，11］。

平菇球形病毒（Oyster mushroom spherical virus，OMSV）是一種侵染為害平菇的正單鏈RNA病毒，于2003年首先被韓國科學家發現并分離［12］。OMSV病毒顆粒為等軸球形，直徑約為27 nm，基因組全長約為5.7 kb，5'-末端沒有帽子結構，3'-末端有多聚腺苷酸尾巴，編碼7個開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）。目前已知其中兩個ORF的編碼產物，分別為病毒的外殼蛋白（Coat Protein，CP）和RNA依 賴 性RNA聚 合 酶（RNA-dependent RNA polymerase，RDRP），其他ORF編碼的氨基酸序列與GenBank中已知的氨基酸序列沒有同源性［2，12］。平菇被OMSV侵染后，出現菌絲退化、菌柄短粗等癥狀［12］，這些癥狀使平菇經濟價值降低，從而導致平菇種植業損失嚴重。檢測鑒定平菇球形病毒，特別是檢測平菇菌種是否攜帶該病毒，對生產實踐具有重要意義。

本研究應用深度測序技術，鑒定子實體表現畸形癥狀平菇樣品中的OMSV，并分析與OMSV序列匹配的siRNA的分布規律和拼接序列與參比序列的比對結果，旨在為其他種類的食用菌中的病毒檢測鑒定提供借鑒和參考，并為深入研究OMSV與平菇的互作過程提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

平菇樣品采集于北京市順義區。樣品表現癥狀為菌柄短粗，菌蓋褐化程度嚴重，子實體畸形變小，生長受到阻滯（圖1）。

圖1 疑似被病毒侵染的平菇

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取和質量檢測 采用mirVanaTMmiRNA Isolation Kit（Ca#t. AM1560 Austin TX，US）并根據說明書進行樣品總RNA的抽提純化，之后對抽提純化后的總RNA進行質量檢測。

1.2.2 深度測序和序列拼接 委托上海伯豪生物技術有限公司進行深度測序（illumina solexa，HiSeq 2500 System）。測序樣本文庫構建時，按照“TruSeq Small RNA Sample Preparation Guide”對純化后的樣品總RNA依次進行3'端接頭連接、5'端接頭連接，反轉錄、擴增、cDNA純化等步驟，從而完成測序樣本文庫的構建。測序后，篩選出與病毒庫序列匹配的siRNA，進行預處理，去除siRNA兩側接頭序列和低質量序列標簽（reads）。隨后使用軟件Clc Genomics Workbench（CLC bio，版本6.5）進行序列拼接，軟件運行時長度參數設置為200，其他參數均為軟件默認值。siRNA序列信息上傳到GenBank數據庫（序列號為SRR1395331）。

1.2.3 拼接序列比對 使用本地化的Blast軟件（ftp：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/ LATEST，版本號2.2.29），進行拼接序列的比對，序列比對時所使用的數據庫為從NCBI網站（www. ncbi.nlm.nih.gov）下載的病毒數據庫（時間為2014年3月2日，共有1 498 320個條目，均以FASTA格式保存）。

1.2.4 vsiRNA及拼接序列seq22的分析 使用Microsoft office軟件，利用數理統計的方法，分析與OMSV序列（ID：NC_004560.1）匹配的siRNA在病毒基因組上的分布規律，以及拼接序列與OMSV序列的比對結果。

1.2.5 PCR驗證 根據序列核酸比對結果，使用軟件DNAMAN（版本6.0，LynnonBiosoft）設計引物OMSV4910F：5'-TACCCCCCCAGGATCTCAAGCTTCT-3'和OMSV5556R：5'-TGAAAGCGCGTCCATCAGAACCATTC-3'，擴增cp基因部分片段，預期產物大小為646 bp。PCR擴增程序為：95℃起始變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火35 s，72℃延伸40 s，35個循環；最后72℃延伸10 min。PCR產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離。使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（北京天根生化科技公司）回收相應大小的PCR產物。回收產物連接到pMD18-T載體（大連寶生物工程公司），陽性克隆由北京華大基因科技有限公司進行序列測定。使用DNAMAN（版本6.0，LynnonBiosoft）對測序結果進行序列比對。

1.2.6 深度測序的結果與預測軟件結果的比較 用4種siRNA預 測 軟 件（siDESIGN Center，http：// www.thermoscientificbio.com/design-center/；DSIR，http：//biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR.html；OptiRNA，http：//optirna.unl.edu/；WI siRNA Selection Program，http：//sirna.wi.mit.edu/）對OMSV基因組產生siRNA分布情況進行預測，并將深度測序數據中與OMSV匹配的siRNA分布情況與軟件預測結果的分布情況進行比較。

2 結果

2.1 平菇樣品總RNA質量

提取的平菇樣品總RNA經過質量檢測，A260/A280=2.08，符合分離小RNA和建立cDNA文庫的標準（表1）。

表1 平菇病害樣品總RNA質檢信息

2.2 與OMSV序列匹配的 siRNA分析

對siRNA測序結果進行分析，去除接頭序列和低質量標簽（reads），使用本地化BLAST與病毒基因庫進行比對，發現與病毒序列匹配的siRNA有5 409條，其中有3 075條siRNA與OMSV的序列（ID：NC_004560.1）匹配。按照vsiRNA的來源進行分析，發現由OMSV正鏈形成的siRNA有2 029條，占總數的66%；由OMSV互補鏈形成的siRNA有 1 046條，占總數的34%，即由病毒正負鏈產生的siRNA比例接近2∶1。

對5'端起始核苷酸進行分析，發現以腺嘌呤核糖核苷酸（A）為起始核苷酸的siRNA有674個，占總數的22%；以胞嘧啶核糖核苷酸（C）為起始核苷酸的siRNA有1 073個，占總數的35%；以鳥嘌呤核糖核苷酸（G）為起始核苷酸的siRNA有666個，占總數的22%；以尿嘧啶核糖核苷酸（U）為起始核苷酸的siRNA有660，占總數的21%（圖2）。

圖2 5'端起始核苷酸不同的vsiRNA之間的比例

按照OMSV上ORF的分布情況進行分析（以vsiRNA的5'端的起始位置作為分類標準），發現有編碼CP的區域產生了最多的vsiRNA，是產生vsiRNA的熱點區域（表2）。

2.3 與OMSV序列匹配的拼接序列分析

使用Clc Genomics Workbench軟件對與病毒序列匹配的siRNA進行序列拼接，拼接序列經過本地化的blast比對后，其中有3條拼接序列與OMSV序列（ID：NC_004560.1）匹配（表3），與OMSV序列匹配上的序列總長度為5 096 nt，占OMSV序列的88%。

選取長度最大的拼接序列seq22進行詳細分析。Seq22長度為2 747 nt，與OMSV序列（NC_004560.1）的核酸序列相似度為79.69%。按ORF的分布情況，將seq22序列分成4個區域，這4個區域分別參與

編碼RDRP、14.5 kDa、CP和23 kDa 4種蛋白。

表2 vsiRNA在病毒基因組上的分布

表3 拼接序列與平菇球形病毒基因組的匹配及相似度

使用DNAMAN（版本6.0，LynnonBiosoft）軟件從核酸序列和氨基酸序列水平比對seq22和OMSV基因組序列（ID：NC_00-4560.1）對應區域的相似性（表4）。比對結果表明，在編碼RDRP和CP的ORF區域，seq22與OMSV基因組參考序列核酸序列之間相似性較低，但氨基酸序列之間相似性較高；在編碼14.5 kD蛋白和23 kD蛋白的ORF區域，seq22與OMSV基因組參考序列核酸序列之間和氨基酸序列之間相似性均較低。

表4 拼接序列seq22與OMSV基因組序列相應區域的核苷酸和氨基酸相似性對比

2.4 RT-PCR驗證

根據序列拼接結果，設計引物OMSV4910F和OMSV5556R，利用RT-PCR擴增cp基因部分序列（圖3）。經測序和序列分析，該PCR產物為OMSV的部分cp序列，與OMSV標準序列（ID：NC_004560.1）的cp基因核酸序列相似度為91%，與相應拼接序列（seq22）的核酸序列相似度為99%。

圖3 OMSV cp基因PCR檢測電泳圖

2.5 深度測序與預測軟件分析siRNA分布的比較

將深度測序數據中與OMSV匹配的siRNA的分布情況與4種siRNA預測軟件（siDESIGN Center，http：//www.thermoscientificbio.com/designcenter/；DSIR，http：//biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR. html；OptiRNA，http：//optirna.unl.edu/；WI siRNA Selection Program，http：//sirna.wi.mit.edu/）的預測結果的分布情況進行比較后發現，實際情況與預測結果存在較大差異（圖4），預測結果表明編碼RDRP的區域是siRNA產生的熱點區域，而測序結果中編碼CP的區域是siRNA產生的熱點區域。

圖4 預測軟件結果與深度測序結果的比較

3 討論

通過深度測序鑒定病毒是近幾年來快速發展的病毒鑒定新技術，已在多個物種中應用。與常規鑒定病毒的技術（如PCR）相比，應用深度測序技術鑒定病毒的方法（以下簡稱深度測序）具有一些優勢，特別是在發現新病毒方面。深度測序可以病毒序列等信息未知的情況下，只需提取總RNA，分離siRNA，構建文庫后進行測序，經序列比對即可對某一或一群生物體內的幾乎所有病毒進行發現和鑒定，靈敏度高，適用性強，獲得的信息豐富；缺點是操作過程復雜，技術要求高，成本高。而常規應用PCR 和RT-PCR檢測和鑒定病毒的方法（以下簡稱RT-PCR）需要病毒的基因組部分序列，適用于研究比較清楚的病毒，檢測針對性強，一次反應僅能檢測一種至多種病毒，如果病毒序列變異大，極易出現錯誤結果，優點是已經普及，成本低。

目前，對食用菌病毒研究相對較少，可以利用的序列信息也較少。食用菌栽培生產中有多種不正常生長表現，多為子實體畸形或者不發菇。利用常規的分子生物學技術，如RT-PCR方法、酶聯免疫方法和提取雙鏈RNA的方法對病毒進行檢測，由于序列特異性強、檢測靈敏度低等缺點，難以對食用菌病毒做到全面檢測和鑒定，特別是尚未有報道的病毒［13］。

由OMSV正鏈形成的vsiRNA與由OMSV基因組互補鏈形成的vsiRNA之間的比例為2∶1。鑒于OMSV為正單鏈RNA病毒，因此推測OMSV衍生出的雙鏈和自身單鏈均是vsiRNA的主要來源。這可能是由于OMSV的正單鏈RNA自身形成了較多的發卡等二級結構。同時，平菇中以堿基C為5'端起始核苷酸的vsiRNA數量明顯多于其他vsiRNA，這可能是由于RNA干擾過程中，起相關作用的酶具有偏好性的緣故。

經過分析vsiRNA在OMSV序列上的分布規律，發現編碼CP的區域是siRNA產生的熱點區域。主要原因可能是因為該區域產生的siRNA具有較高的沉默效率，也有可能是因為其他未知因素。為了證實這一推測，將深度測序數據中與OMSV匹配的siRNA的分布情況與4種siRNA預測軟件的預測結果的分布情況進行比較，結果表明軟件預測RDRP區域為siRNA產生熱點區域，與深度測序結果差異較大。由于預測軟件的算法是主要基于靶向序列的一級結構［14-16］，因此可以推斷編碼CP的區域成為熱點區域的主要原因有可能是一級結構以外的其他原因。這些原因有可能與功能有關，CP是在病毒與寄主互作中的重要因子，寄主的防御系統將沉默的重點區域設定為編碼CP的區域，有助于寄主抵御病毒。除了功能原因以外，二級結構也有可能是形成熱點區域的重要原因［17，18］。

在分析拼接序列seq22的不同區域是否存在同義突變時，發現了兩個特殊區域，分別參與編碼14.5 kD蛋白和23 kD蛋白。與OMSV編碼RDRP、CP區域不同的是編碼14.5 kD蛋白和23 kD蛋白核酸序列的變異直接導致氨基酸序列的改變，這種改變有可能使得這些區域編碼的產物功能發生變化。因此這些區域編碼的產物有可能在病毒與環境的互

作中起重要作用［19，20］。但由于這兩個區域編碼的產物功能未知，仍有待于進一步試驗證明。

4 結論

本研究應用深度測序技術鑒定了平菇樣品中的平菇球形病毒（OMSV），并使用RT-PCR的方法進行了驗證；利用生物信息學技術初步分析了與OMSV有關的siRNA在病毒基因組上的分布情況。

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（責任編輯 馬鑫）

Identification of Oyster Mushroom Spherical Virus in Pleurotus ostreatus by Deep Sequencing

Wang Shaojie1Wang Nian1Shi Yingchun2Hu Xiaoyan3Zhou Tao1
（1. College of Agriculture and Biotechnology，China Agriculture University，Beijing 100193；2. Beijing Plant Protection Station，Beijing 100029；3. Beijing Agricultural Technical Extension Station，Beijing 100029）

To identify viruses in malformed Pleurotus ostreatus samples collected in Shunyi district in Beijing, deep sequencing of small RNA from total RNA was performed. Consequently, there were 3 075 small interfering RNAs（siRNAs）pairing to the complete sequence of Oyster mushroom isometric virus（OMSV）（NC_004560.1）. These siRNAs were located in most regions on genome of OMSV, some of which formed hot-spots. By putting these siRNAs together, three contigs with length more than 500 nucleotides were assembled. According to the sequence of one of these contigs, seq22, a pair of primers was designed to amplify partial coat protein gene via RT-PCR. The results showed that cloned sequence was similar to the

equence and to the contig with identities of 91% and 99%, respectively. These results confirmed OMSV in the collected mushroom samples. Meanwhile, the related data acquired from deep sequencing was compared to the predicted siRNAs obtained by four softwares, showing that they were different from each other. The difference was discussed.

Pleurotus ostreatus Deep sequencing Oyster mushroom spherical virus siRNA Contig

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.014

2014-05-04

2013年食用菌創新團隊崗位專家工作經費（PXM2013_036203_000055）

王少杰，男，碩士研究生，研究方向：植物病毒；E-mail：wangshaojiestrong@163.com

周濤，男，副教授，研究方向：植物病毒；E-mail：taozhoucau@cau.edu.cn

師迎春，女，研究員，研究方向：蔬菜和食用菌病蟲害；E-mail：shiych@126.com