玉竹多酚微波輔助提取工藝優化及體外抗氧化活性研究

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(湖南人文科技學院,湖南婁底 417000)

玉竹(Polygonatumodoratum(Mill. )Druce)為百合科黃精屬的多年生草本植物,其干燥根莖又名尾參、玉參,是藥食兩用的植物資源,中醫常做補陰藥,臨床常用于治熱病傷陰、咳嗽煩渴、虛勞發熱、消谷易饑、小便頻數等癥[1]。我國玉竹資源豐富,栽培歷史悠久,不同生長地域的玉竹的活性物質和微量元素含量有很大的差別,其中湖南湘玉竹品質較佳。隨著對玉竹研究的不斷深入,人們已從該植物中分離純化出多糖、甾體皂苷,黃烷酮類、揮發油、強心苷、生物堿等多種活性成分[2],但對玉竹多酚的相關研究尚很少報道。現代藥理學研究發現,玉竹提取物除了具有明顯的降血糖、提高免疫功能、抗腫瘤作用外,還具有抗衰老、治療白癜風等作用[3 - 5]。近年來,人們還利用其功能活性開發了玉竹茶、玉竹汁、玉竹復合飲料等保健食品及玉竹中藥化妝品等相關產品,其綜合利用經濟價值逐漸引起人們的重視。

表1 各單因素實驗水平設計Table 1 Single variable test design

微波技術具有加速細胞破解、加快內部活性物質溶出等優點,作為現代植物有效成分提取的新方法,已廣泛用于多種天然物質的萃取[6 - 8]。本文采用微波輔助提取(MAE)玉竹多酚,利用響應曲面法優化玉竹多酚的提取工藝,并研究玉竹多酚的體外抗氧化活性,為建立合理的玉竹多酚制備方式提供技術支持,為玉竹多酚的深入研究提供實驗基礎和理論依據,對綜合開發、利用玉竹資源有著積極的意義。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

玉竹 由湖南省邵東縣玉竹生產基地提供,經湖南省婁底市科研所劉澤發副研究員鑒定為百合科植物玉竹。其根莖經45℃烘干,粉碎,過60目篩,0 ～ 4℃保存備用;二苯基苦味酰基苯(DPPH)、鄰苯三酚、沒食子酸標準品、福林 - 酚試劑(FC) 購于Sigma公司;其他試劑均為國產分析純。

微波萃取儀 奧地利安東帕公司(Multiwave 3000)16SOLVMF100轉子,配備磁力攪拌裝置;UV - 1240紫外分光光度計 日本島津;冷凍離心機 美國熱電。

1.2福林酚法測定玉竹多酚含量

測定多酚含量的方法參考文獻[9 - 10],并略作修改,稱取玉竹粉1g,加入乙醇溶液,在一定的微波功率下提取一定時間,真空抽濾,濾液經3500r/min離心分離5min,取上清液定容至50mL容量瓶。準確移取樣品液5. 0mL于50mL容量瓶中,加入FC試劑1. 0mL充分混合后靜置1min,加入10mL 7%的碳酸鈉溶液,充分混合后用蒸餾水定容,置30℃恒溫水浴中反應1h,不斷振蕩。在波長765nm處測定吸光度值(以蒸餾水為空白對照)。

樣品中多酚物質含量(以沒食子酸計,mg/g)

GAE=X×V1×V2/W

式中,X為根據標準曲線求得的樣品濃度值(mg/mL);V1為樣品液稀釋倍數;V2為樣品液總體積(mL);W為原料重量(g)。

1.3單因素實驗

稱取玉竹粉1g,放置于250mL錐形瓶中,加入一定量的乙醇溶液,用保鮮膜封口,避光放置潤濕20min,使溶液充分滲入細胞組織內,經微波輻射后真空抽濾,濾液經3500r/min離心分離5min后定容到50mL容量瓶中作為玉竹多酚提取樣液,測定多酚含量。用微波功率240W、微波萃取儀爬坡時間(微波功率從0W上升到設定功率的時間)10min、保持時間(提取時間)25min、料液比1∶ 30(g/mL),乙醇濃度50%,作為單因素篩選實驗的基礎條件。研究微波功率、保持時間、料液比、乙醇濃度中的某一因素時,其他條件保持不變,單因素實驗設計見表1。

1.4微波輔助提取(MAE)玉竹多酚的工藝優化實驗

在單因素實驗基礎上,綜合考慮各因素對玉竹中多酚物質得率的影響,采用統計分析軟件Design -Expert7. 0建立4因素3水平的響應面分析實驗[11 - 12],通過實驗確定最優提取工藝,以玉竹多酚得率作為響應值,選擇微波功率、提取時間、料液比、乙醇體積分數為自變量,變量編碼值根據下列方程確定:

χi=(Xi-X0)/Xi

式中:χi- 自變量代碼值;Xi- 自變量真實值;X0- 在實驗中心點自變量的真實值;Xi- 自變量的變化步長。自變量X1(微波功率,W),自變量X2(輻射時間,S),自變量X3(料液比),自變量X4(乙醇體積分數,%),4個自變量因素編碼及水平見表2。

表2 自變量因素編碼及水平Table 2 Independent variable coding and level

注:對真實值的特征編碼:χ1=(X1- 300)/60;χ2=(X2- 25)/5;χ3=(X3- 30)/10;χ4=(X4- 50)/10。

1.5體外抗氧化性能測定

1. 5. 1 對DPPH自由基清除能力的測定 參考Luo等[13]的方法,同時作適當修改,取玉竹多酚和維生素C母液分別稀釋成0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0、2. 0、3. 0、3. 5μg/mL的溶液,吸取不同濃度的玉竹多酚和維生素C溶液2mL,加入2mLDPPH·溶液(0. 2mmol/L)搖勻,避光放置30min,以無水乙醇調零,測定517nm波長處的吸光度(Ai);分別測定2mL不同濃度的玉竹多酚和維生素C溶液與2mL無水乙醇混合液的吸光度作為對照(Ac);測定2mL蒸餾水溶液與2mL無水乙醇混合液的吸光度作為空白(A空白),計算清除率。

清除率(%)=[(Ac-Ai)/Ac]×100

1. 5. 2 對超氧陰離子清除能力的測定 采用鄰苯三酚自氧化法,參考李興飛等[14]實驗方法并略作修改。具體方法如下:將處理得到的玉竹多酚樣品用無水乙醇配制成質量濃度分別為0. 25、0. 5、0. 75、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5mg/mL的溶液。取上述各溶液1mL置于10mL試管中,依次加入3. 8mL蒸餾水,5. 0mL 0. 05mol/L Tris - HCl(ph8. 3),0. 2mL 2mmol/L鄰苯三酚,迅速混勻,測定A322,每隔1min測定1次,直到反應后第5min,求斜率V。以蒸餾水作空白調零;以維生素C作實驗對照,求得清除率K1

計算公式如下:

清除率K1(%)=(Vs-V)/Vs×100

式中:Vs- 1mL蒸餾水與反應體系反應的速率;V- 1mL樣品液與反應體系反應的速率。

2 結果與討論

2.1單因素實驗及結果

2. 1. 1 微波功率對多酚含量的影響 如圖1a所示,當功率300W時多酚含量最高,而當大于功率300W時,多酚含量降低,在一定時間內,微波功率越高,體系升溫越快,固液擴散速度也越快,有利于物料中有效成分的浸出。然而,當微波功率過大時,多酚易發生氧化和降解[7]。

2. 1. 2 微波輻射時間對多酚含量的影響 從圖1b可以看出,當微波輻射提取時間為25min時,多酚含量最高;當輻射時間大于25min時,隨著時間的延長,多酚含量開始下降,這可能是因為提取溶劑溫度的不斷升高以及高溫提取時間的延長,導致多酚類物質降解,從而使多酚含量下降。另外,時間越長,耗能越大,所以最佳微波輻射時間為25min。

2. 1. 3 料液比對多酚含量的影響 圖1c表明,隨著料液比的增大,多酚含量逐漸升高,當料液比為1∶ 30(g·mL-1)時,多酚含量到達最大值,之后繼續增大料液比,多酚含量略有下降并趨于平緩,溶劑用量多少,關系生產成本,并為后續的濃縮操作帶來較大的工作量。因此,最佳料液比1∶ 30(g·mL-1)。

2. 1. 4 乙醇體積分數對多酚含量的影響 如圖1d所示,隨著乙醇體積分數的增加,多酚得率呈先升高后降低的趨勢。當乙醇體積分數50%時多酚得率最高,因此,最佳乙醇體積分數為50%。

圖1 玉竹多酚提取單因素實驗結果Fig. 1 Single variable test of polyphenols extraction from Polygonatum odoratum

2.2微波提取實驗模型建立與顯著性檢驗

2. 2. 1 模型建立與顯著性檢驗 設計并優化的29組實驗安排及實驗結果見表3。運用對表2實驗數據進行多元回歸擬合,獲得響應值——多酚含量(Y)與4個因素二次多項式回歸模型:

Y= - 376. 01+0. 71X1+12. 61X2+2. 15X3+5. 41X4+0. 0053X1X2+0. 0027X1X3- 0. 0015X1X4+0. 0035X2X3- 0. 06X2X4- 0. 004X3X4- 0. 0013X12- 0. 22X22- 0. 044X32- 0. 034X42

由表4回歸模型的方差分析可知,模型p=0. 0015,表明模型極其顯著;F回歸=5. 50>F0.01(14,14)=3. 70,p=0. 0015,表明二次多元回歸模型極其顯著;F失擬=3. 290. 05,失擬項不顯著,該方程對實驗擬合較好,可以對不同條件下的玉竹多酚提取率進行預測;模型的決定系數R2=0. 8461,說明用該模型可以解釋84. 61%響應值的變化。

由表5中模型系數的顯著性檢驗數據可知,一次項X1和二次項X12、X22、X32、X42對多酚含量的影響達極顯著水平,一次項X3和交互項X2X4對多酚含量的影響均達顯著水平,由F值可知4個因素對玉竹多酚含量的影響依次為:X1(微波功率)>X3(料液比)>X2(提取時間)>X4(乙醇體積分數)。

表3 Box - Behnken實驗設計及結果Table 3 Box - Behnken design and data of the investigated responses of extracts

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

為進一步確定最佳點的數值,對回歸方程取一階偏導數,并令其等于零,代入編碼公式得多酚提取的最佳工藝:X1(微波功率)=329. 17W,X2(輻射時間)=26. 12min,X3(料液比)=1∶ 33. 86,X4(乙醇體積分數)=49. 03%。

2. 2. 2 模型驗證 結合回歸模型的數學分析結果,微波輔助提取玉竹多酚的最佳工藝參數為:微波功率329. 17W,提取時間26. 12min,料液比1∶ 33. 86,乙醇體積分數49. 03%。在此條件下玉竹多酚理論提取含量為67. 52mg/g,為考慮實際生產工藝,將工藝參數調整為微波功率329W,提取時間26min,料液比1∶ 34,乙醇體積分數49%,在此條件下,玉竹多酚提取含量為67. 40mg/g,兩者非常接近,說明該模型可靠。

表5 回歸模型系數的顯著性檢驗Table 5 Significance test of coefficients of regression model

注:* *表示p<0. 01,極顯著;*表示p<0. 05,顯著。

通過多酚含量回歸方程所繪制的響應曲面圖及等高線圖,見圖2 ～ 圖7。各圖顯示微波功率、微波輻射時間、乙醇體積分數和料液比中任意兩個變量取零水平時,其余2個變量對玉竹多酚含量的影響。

圖2 微波功率和輻射時間對多酚含量的影響Fig. 2 Effect of microwave power and microwave time on polyphenols yield

曲面圖的形狀可反應出單因素對多酚含量的影響,曲面越陡峭,影響越顯著。從圖2 ～ 圖7的對比中可以得出各因素對玉竹多酚含量影響大小依次是微波功率>液料比>微波輻射時間>乙醇體積分數,與方差分析結果一致(F值大小反映了各因素對玉竹多酚含量的影響)。

擬合的響應面和等高線圖比較直觀地反映了各因素間的交互作用。根據圖中等高線的形狀(圓形或橢圓形),可以看出相應兩個變量之間的交互作用是否顯著。圓形的等高線表明交換作用較小,可以忽略;而橢圓的等高線則表明交換作用較為顯著或極其顯著。圖6中等高線為橢圓形,說明X2X4交互作用顯著;圖2 ～ 圖5、圖7的等高線呈圓形,說明X1X2、X1X3、X1X4、X2X3、X3X4的交互作用不顯著,與方差分析的結果相一致。從響應面和等高線圖可以看出,在所選范圍內存在極值,即響應面最高點,同時也是等高線最小橢圓的中心點。

圖3 微波功率和料液比對多酚含量的影響Fig. 3 Effect of microwave power and ratio of solvents to raw material on polyphenols yield

圖5 微波輻射時間和料液比對多酚含量的影響Fig. 5 Effect of microwave time and ratio of solvents to raw material on polyphenols yield

圖6 微波輻射時間和乙醇體積分數對多酚含量的影響Fig. 6 Effect of microwave time and ethanol concentration on polyphenols yield

圖7 料液比和乙醇體積分數對多酚含量的影響Fig. 7 Effect of ratio of solvents to raw material and ethanol concentration on polyphenols yield

2.3玉竹多酚抗氧化性能

2. 3. 1 玉竹多酚對DPPH自由基清除能力 由圖8可以看出,在質量濃度0. 25 ～ 0. 75μg/mL范圍,玉竹多酚對DPPH·的清除率低于VC,在質量濃度1. 0μg/mL以上時,玉竹多酚的清除率與VC清除率相當,在質量濃度3. 5μg/mL時,玉竹多酚的清除率達到87%,說明玉竹多酚對DPPH·具有明顯的清除能力,并且呈明顯的劑量依賴性關系。

圖8 玉竹多酚對DPPH自由基清除率Fig. 8 DPPH radical scavenging rate of Polygonatum odoratum polyphenols

圖9 玉竹多酚對超氧陰離子的清除率Fig. 9 Superoxide anion scavenging rate of Polygonatum odoratum polyphenols

2. 3. 2 玉竹多酚對超氧陰離子清除能力 如圖9所示,玉竹多酚對超氧陰離子具有一定的清除率,當樣品質量濃度達到1. 5mg/mL時,玉竹多酚的清除率為87. 23%,略低于VC的清除率(92. 87%),同時玉竹多酚的清除能力在此濃度下幾乎達到飽和。雖然玉竹多酚對超氧陰離子的清除率略低于同濃度的VC,其較高的清除能力使玉竹可作為潛在的天然抗氧化物質來源。

3 結論

3.1影響玉竹多酚微波輔助提取的主次因素順序為微波功率>料液比>輻射時間>乙醇體積分數。

3.2通過對二次回歸模型優化得到微波輔助提取玉竹多酚的最優工藝為微波功率329W,提取時間26min,料液比1∶ 34(g/mL),乙醇體積分數49%,在此條件下所得的玉竹多酚含量為67. 40mg/g,因此該模型可以很好的預測玉竹多酚提取得率。

3.3體外抗氧化實驗研究表明,玉竹多酚對DPPH·具有明顯的清除能力,并且呈明顯的量效關系。玉竹多酚對DPPH·的清除率與VC清除率相當,當質量濃度為3. 5μg/mL時,玉竹多酚和VC對DPPH·的最大清除率分別達87. 01%、88. 78%;玉竹多酚對超氧陰離子的清除能力略低于同濃度的VC,但仍具有較高的清除能力,當質量濃度為1. 5mg/mL時,玉竹多酚和VC對超氧陰離子的最大清除率分別達89. 32%、94. 21%。

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