響應面分析法優化麥麩酯酶雙水相萃取的條件

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(1. 四川農業大學食品學院,四川雅安 625014; 2. 攀枝花市食品藥品檢驗所,四川攀枝花 617000)

麥麩是小麥加工的副產品,在加工中其產量將近小麥加工量的20%[1]。我國每年小麥面粉廠加工出的麥麩可達2000萬t以上,但大多數都只是被作為飼料原料而直接利用[2],經濟價值低。而谷物皮層具有重要的營養學特性[3]。植物酯酶(plant esterase,PE),屬于羧酸酯水解酶類,為親水性蛋白質,存在于植物各個部位、不同發育時期的細胞中[4],主要存在于小麥、玉米、大豆等谷物中[5]。其等電點約為4. 2[6 - 8],最適pH為6. 5,最適溫度為45℃,在40℃以下,pH6. 5 ～ 8. 0之間有較好的穩定性,其活性可被某些金屬離子抑制,而在有機溶劑中有較好的耐受能力[9]。植物酯酶可作為農藥殘留檢測的三種酶標記物之一,而且其與膽堿酯酶相比,具有來源廣泛,價格低廉,檢測時間短,檢測靈敏性好,檢測限低等優點,得到廣泛關注[10]。

雙水相萃取系統是由水溶性的兩種聚合物或一種水溶性聚合物與一種鹽和水構成的三組分雙相體系[11]。雙水相萃取技術易于操作、設備簡單,更重要的是雙水相萃取避免了傳統液 - 液萃取中生物活性物質與有機溶劑的直接接觸,保護了其活性。并且雙水相體系的生物親和性,可以使初步純化的蛋白質直接用于后續研究中,使操作趨于簡便。所以其應用前景廣闊,尤其是在酶的分離純化方面得到了越來越多的關注[12 - 15]。本研究采用PEG/鹽雙水相萃取技術純化麥麩酯酶,通過對成相物質、成相物質濃度、pH、離子強度等因素的考察,探討對麥麩酯酶的總蛋白分配系數、酶活回收率、純化倍數的影響,采用響應面法優化萃取條件,建立一種簡單可行的純化麥麩酯酶的方法。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

1. 1. 1 主要材料 麥麩(雅安市售普通麥麩);聚乙二醇/PEG(分子量為600、1000、2000、4000、6000) 中國醫藥集團上海化學試劑公司;考馬斯亮藍 - G250 上海易利生物科技有限公司;α - 乙酸萘酯 上海億欣生物科技有限公司;固蘭B 上海江萊生物科技有限公司;牛血清白蛋白 鹽城賽寶生物科技有限公司;十二烷基硫酸鈉(SDS) 河南金海化工;其余試劑均為分析純;實驗用水 為超純水。

1. 1. 2 主要儀器 UV - 3100型紫外分光光度儀計,上海美譜達儀器有限公司;CP225D型電子天平,德國賽多利斯公司;HH - 2型數顯恒溫水浴鍋,江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;ST16R型冰凍離心機型,美國Thermo Fisher Sorvall公司;FW - 400A型傾斜式高速萬能粉碎機,北京中興偉業儀器有限公司;Milli - Q型超純水純化系統,美國Millipore公司。

1.2實驗方法

1. 2. 1 麥麩酯酶萃取工藝流程 本研究前期已采用響應面法優化麥麩酯酶提取方法,確定麥麩酯酶的最佳提取方法。得出最佳提取工藝條件:NaNO3濃度0. 15mol/L、提取溫度35℃、提取時間60min,此條件下單位酶活的預測值為23338U/mL,驗證值為23018. 7U/mL,達到預測值的98. 63%。

麥麩→粉碎→0. 15mol/L pH6. 5的NaNO3磷酸緩沖液1∶ 5(g/mL)浸提→35℃水浴60min→過濾→8000 r/min 4℃離心5min→粗酶液→雙水相萃取

1. 2. 2 雙水相相圖的制作 將不同分子量的PEG和硫酸銨制成一定濃度的原液,準確稱量一定量的PEG原液,加入三角瓶中,然后加入硫酸銨原液,混合,直至開始出現混濁為止,計算加入硫酸銨的量,算出PEG和硫酸銨在系統中的質量百分濃度,再加入適量(約1g)蒸餾水,使體系變澄清,計量加入蒸餾水的量,并繼續加入硫酸銨原液,使系統再次變混濁,如此反復操作,計算混濁時系統中PEG和硫酸銨在系統中的質量百分含量,從而根據如下公式獲得相圖曲線[21]

式中:P:在某單相點時PEG在系統中的總量(g);Q:在某單相點時硫酸銨在系統中的總量(g);W:在某單相點時水在系統中的總量(g);X:在某單相點時PEG的質量分數;Y:在某單相點時硫酸銨的質量分數。

1. 2. 3 酶活力的測定

1. 2. 3. 1 α - 萘酚標準曲線的繪制 將0. 25mL不同濃度α - 萘酚標準溶液加入到4. 5mL pH7. 2的磷酸氫鈉緩沖液中,40℃恒溫水浴8min,取出加入0. 25mL 0. 03%固蘭B鹽溶液,再加入0. 25mL 4. 25%SDS溶液搖勻,加入0. 25mL 1∶ 1鹽酸溶液后在599nm處讀取OD值,用未加α - 萘酚標準溶液作空白。以α - 萘酚濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線,結果Y=834. 57X - 0. 1272。

麥麩酯酶酶活性單位定義——每分鐘催化得到1μmol α - 萘酚所需的酶量定義為1U,單位為μmol/min。

1. 2. 3. 2 測定酯酶酶活力方法 在4. 25mL pH7. 2的磷酸緩沖液中加入0. 2mL按一定比例稀釋的酶液,再加入0. 25mL濃度為8×10-4mol/L的α - 乙酸萘酯溶液,混合均勻后在40℃的恒溫水浴中預熱5min,依次加入0. 25mL 4. 25%SDS水溶液和0. 25mL 0. 03%固蘭B鹽溶液混合均勻且反應終止,最后加0. 25mL 1∶ 1鹽酸溶液。以不加底物(α - 乙酸萘酯)的溶液作空白,用分光光度計進行檢測,在波長599nm測定吸光度值。實驗管減去對照管的吸光度值,其差值可根據α - 萘酚標準工作曲線查找含量值。

樣品中麥麩酯酶酶活力(U)=(C1- C2)×N×V1/5×V2

式中:C2- 樣品中麥麩酯酶濃度(μmol/mL);C1- 空白對照麥麩酯酶濃度(μmol/mL);V1- 反應液總體積(mL);V2- 樣品反應時所吸稀釋液的體積(mL);N - 酶液稀釋倍數;5 - 測定反應時間為5min。

1. 2. 4 蛋白質含量的測定 以牛血清白蛋白作為標準,參照考馬斯亮藍G - 250法測定蛋白質含量[16]。

1. 2. 5 雙水相體系的操作 準確稱取2gPEG和1. 5g無機鹽于帶刻度的離心管中,加適量水,室溫下在漩渦混勻器上混合10min至充分溶解,再加入1mL粗酶液,用蒸餾水調至10g,混勻后2000r/min 4℃離心5min。分別測定上下相體積、酶活和蛋白含量,同時測定未經雙水相處理的原酶液酶活和蛋白含量,按以下公式進行計算。

相比(R)=上相體積/下相體積

分配系數(K)=上相酶活/下相酶活

回收率(Y)=RK/(1+RK)

比酶活=酶活/蛋白含量

純化倍數=上相比酶活/原酶比酶活

1. 2. 6 單因素實驗 分別考察PEG相對分子量和濃度、無機鹽種類和濃度、pH及外加無機鹽6個因素對麥麩酯酶萃取效果的影響,以麥麩酯酶的總蛋白分配系數、酶活回收率、純化倍數為指標,各水平重復3次,單因素實驗因素及水平見表1。

1. 2. 7 響應面法優化實驗 在單因素實驗的基礎上,根據Box - Benhnken中心組合原理,確定實驗的因素與水平,以純化倍數為響應值。利用Design Expert 7. 0軟件設計響應面實驗,從而得出各因素之間的最佳組合。每個實驗做3組平行,取其平均值,中心組合實驗因素與水平設計如表2所示。

表2 響應面設計因素水平表Table 2 Factors and levels in the center composite design

表1 單因素實驗因素與水平Table 1 Coded levels for independent variables used in one - factor - at - a - time design

2 結果與分析

2.1PEG/(NH4)2SO4雙水相系統相圖

圖1為5種不同平均分子量的PEG和(NH4)2SO4組成的雙水相系統相圖。由于萃取是在兩相條件下進行的,所以選擇在雙節線上方的質量百分點作為參考條件。當(NH4)2SO4濃度一定時,隨著PEG相對分子質量的增大,形成雙水相體系所需PEG的濃度降低。其原因可能是PEG相對分子質量越大,其憎水程度越強,且加大其與(NH4)2SO4分相的動力,導致臨界分相濃度降低。

圖1 雙水相相圖Fig. 1 Two - phase aqueous diagram

2.2雙水相體系的優化

由于核酸與多糖多分配于鹽相,并且高鹽濃度易造成酶失活,因此目標酶分配系數高的體系更有利于酶的分離。本研究目的是對麥麩酯酶進行分離純化,因此對麥麩酯酶純度要求高,在選擇分離體系時應優先考慮比酶活與純化倍數,同時適當的回收率也是后續實驗的保障。

2. 2. 1 單因素實驗結果

2. 2. 1. 1 無機鹽種類對萃取效果的影響 本實驗選擇20%(m/m)PEG 1000分別與質量濃度均為15% MgSO4、(NH4)2SO4、NaH2PO4、Na2SO4組成雙水相體系,測定純化倍數、分配系數和回收率(體系pH為自然pH,約4. 3)。如圖2所示,PEG 1000/(NH4)2SO4組成的雙水相體系的分配系數均顯著高于其他體系,回收率和純化倍數也略高于其它體系,且(NH4)2SO4分相速度快,故選擇(NH4)2SO4與PEG組成雙水相體系成相物質。

圖2 無機鹽種類對萃取效果的影響Fig. 2 Effect of inorganic salts on the extraction efficiency

2. 2. 1. 2 PEG相對分子量對萃取效果的影響 圖3為20%(m/m)分子量為600、1000、2000、4000、6000PEG分別與質量分數為15%的(NH4)2SO4組成雙水相體系時,麥麩酯酶在兩相間純化倍數、分配系數和回收率的變化趨勢(體系pH為自然pH,約4. 3)。結果表明,PEG1000體系對麥麩酯酶萃取的純化倍數最大,雖然分配系數和回收率較PEG 600體系略低,但是差異并不明顯。與PEG 1000相比,分子量為2000、4000、6000組成的PEG/(NH4)2SO4體系的萃取效果顯著下降,且隨著分子量的增大,各項指標均呈下降趨勢。這是由于低分子量的PEG親水性較強,隨著PEG分子量的增大,其親水性降低,而酯酶是親水性的蛋白質,大量的水被分配到了無機鹽相中,導致PEG相中的酯酶減少。綜合考慮,選擇PEG1000與(NH4)2SO4構成雙水相萃取體系。

圖3 PEG相對分子量對萃取效果的影響Fig. 3 Effect of relative molecular weight of PEG on the extraction efficiency

2. 2. 1. 3 無機鹽濃度對萃取效果的影響 圖4為20%(m/m)PEG1000與質量分數為12、14、16、18、20%(NH4)2SO4組成雙水相系統(體系pH為自然pH,約4. 3)。由圖4可知,(NH4)2SO4濃度對麥麩酯酶的回收率并沒有顯著影響。在鹽濃度較低的情況下,隨著鹽濃度的增大,純化倍數和分配系數呈升高的趨勢,此時雙水相體系對麥麩酯酶選擇性逐漸增強;但是當鹽濃度超過18%(m/m)后,純化倍數和分配系數均顯著降低,可能是因為體系中鹽濃度過大,上相中含鹽量增加,抑制了酶的活性。故選擇18%(m/m)(NH4)2SO4與PEG 1000構成的雙水相體系。

圖4 無機鹽濃度對萃取效果的影響Fig. 4 Concentration of(NH)2SO4 on the extraction efficiency

2. 2. 1. 4 PEG濃度對萃取效果的影響 圖5為18%(m/m)(NH4)2SO4與質量濃度為16%、18%、20%、22%、24% PEG1000組成雙水相系統(體系pH為自然pH,約4. 3)。由圖5可知,當PEG濃度較低時,純化倍數和分配系數隨著PEG濃度的增大而增大;但當PEG濃度超過22%時,純化倍數和分配系數反而下降,可能是由于濃度過大,導致相界面張力與相粘度增大,不利于麥麩酯酶進入PEG相。但由于PEG濃度越大,上相體積也顯著增大,雖然單位體積的酶活降低,但酶活回收率變化不大,甚至略有增加。因此,選擇22%(m/m)PEG1000與18%(m/m)(NH4)2SO4構成的雙水相體系。

圖5 PEG濃度對萃取效果的影響Fig. 5 Concentration of PEG on the extraction efficiency

2. 2. 1. 5 pH對萃取效果的影響 體系的pH影響蛋白質和酯酶在溶液中的解離度,引起蛋白質和酶的電荷性改交;另一方面,體系pH的改變,也會引起成相物質分子和相界面的電位差變化,導致麥麩酯酶與成相物質分子間作用變化,使分配系數K發生變化。不同pH對麥麩酯酶分配的影響見圖6。由圖6可知,分配系數和回收率隨pH變化并無明顯規律,在pH4. 5時達到最大,此時分離效果最好。其原因是帶負電荷的蛋白質更優先選擇上相,而帶正電荷的蛋白質通常分配到下相,植物酯酶的等電點約為4. 2,在pH4. 5時,蛋白質電荷呈負電性,酯酶和PEG分子之間的作用增強,故麥麩酯酶的分配系數增加。pH對純化倍數的影響無明顯的規律性,當pH4. 5時,純化倍數最大;隨著pH的增大,純化倍數降低。綜合考慮選擇pH4. 5作為萃取的最佳酸度條件。

圖6 pH對萃取效果的影響Fig. 6 pH on the extraction efficiency

2. 2. 1. 6 離子強度對萃取效果的影響 在雙水相體系中適當增加離子強度,由于陰、陽離子在兩相中的分配差異,形成穿過相界面的電位,從而影響帶電大分子物質在兩相中的分配,強化分配效率,從而加快分配速度,因此一般選擇加入中性鹽。參考其它酶類雙水相萃取條件并結合實驗條件[17 - 19],選擇加入中性鹽NaCl。如圖7所示,麥麩酯酶的純化倍數、分配系數和回收率均隨著NaCl質量分數的增大而降低,所以本體系中添加NaCl反而不利于得到好的萃取效果。分析原因可能是由于Na+與Cl-在兩相分配情況不同,從而引起兩相電位差的變化所致;另外離子強度影響酶的表面疏水性,擾亂雙水相系統,改變各相中物質的組合和相體積比,這種相性質的改變直接影響酶的萃取效果。外加NaCl對麥麩酯酶在該雙水相體系中的影響作用是復雜的,在本實驗的條件下,外加鹽NaC1對植物酯酶的分配是不利的,故選擇雙水相體系中不加入NaCl。

圖7 外加無機鹽對萃取效果的影響Fig. 7 Concentration of NaCl on the extraction efficiency

2. 2. 2 響應面優化實驗

2. 2. 2. 1 模型建立及其顯著性分析 根據單因素實驗結果,采用響應面方法進一步優化實驗條件。根據Box - Benhnken中心組合設計原理,以純化倍數為響應值,在PEG1000/(NH4)2SO4體系基礎上,對PEG濃度(m/m)(X1)、(NH4)2SO4濃度(m/m)(X2)和pH(X3)設計響應面實驗。響應面因素水平編碼表見表2、實驗設計及結果見表3。利用Design -Expert統計軟件對表3實驗結果進行二次多項式逐步回歸擬合,由Box - Benhnken程序計算得到回歸方程:

表3 Box - Benhnken 實驗設計及結果表Table 3 Box - Benhnken experimental design matrix and experimental results

表4 回歸模型的方差分析及顯著性檢驗Table 4 Analysis of varianc and significance test of the regression model

注:* *顯著性在0. 01水平;*顯著性在0. 05水平。

純化倍數(Y)=2. 92 - 0. 025X1- 9. 409×10-4X2-0. 1X3+0. 011X1X2- 0. 013X1X3+0. 022X2X3- 0. 036X12- 0. 041X22- 0. 21X32

2. 2. 2. 2 各因素交互作用對純化倍數的影響 響應面等高線圖能夠直觀地反映出各因素交互作用對響應值的影響,圓形表示二因素交互作用不顯著,橢圓形表示二因素交互作用顯著。如圖8a所示,沿PEG濃度軸向等高線變化密集,而(NH4)2SO4濃度軸向等高線相對稀疏,說明PEG濃度對純化倍數的影響比(NH4)2SO4濃度大;如圖8b和圖8c所示,沿pH軸向等高線變化密集,而PEG和(NH4)2SO4濃度軸分別向等高線相對稀疏。由此可知,pH對雙水相萃取酯酶的純化倍數影響最為顯著,PEG濃度與(NH4)2SO4濃度次之。

表5 驗證實驗結果Table 5 Validation of reliability of optimal sedimentation conditions

圖8 各兩因素交互作用對麥麩酯酶純化倍數影響的響應面圖Fig. 8 Response surface and contour plots for the effect of warious parameters on purification factor

對回歸方程求一階偏導,分別為X1=21. 4,X2=17. 8,X3=4. 38,即最佳萃取條件為:PEG濃度21. 4%,(NH4)2SO4濃度17. 8%,pH4. 38,雙水相萃取麥麩酯酶的純化倍數為2. 9208。結合實際情況考慮,將實驗條件調整后進行驗證實驗,在PEG濃度為21%,(NH4)2SO4濃度18%,pH為4. 4,純化倍數為2. 9190,與預測值相對誤差為0. 06%,說明實驗結果與模型預計理論值基本吻合。這說明,響應面分析法能優化麥麩酯酶雙水相萃取條件因素,利用響應面優化得到的實驗參數真實可靠。

2. 2. 3 驗證性實驗 對回歸方程的合適性和有效性進行驗證,選取未經雙水相萃取的粗提取原酶液和最優條件組進行驗證性實驗,結果見表5。通過與粗酶液比較,發現萃取后的酶液總酶活與比酶活均明顯增大,說明PEG1000/(NH4)2SO4雙水相體系萃取麥麩酯酶是可行的。回歸方程預測雙水相萃取純化倍數可達到2. 9208,三次驗證實驗的平均純化倍數為2. 9190±0. 0068,與預測值相對誤差為0. 06%,證明通過響應面優化后得出的回歸方程具有實踐指導意義。

3 結論與討論

3.1姜彬等[17]運用PEG1000/NaH2PO4雙水相體系萃取小麥酯酶,利用單因素實驗選擇的萃取體系為:PEG1000與NaH2PO4質量分數分別為23%和16%、pH4。相較于本文采用響應面法優化的麥麩酯酶萃取體系存在一定差異,分析可能由于酯酶來源不同有關。

3.2PEG/鹽體系萃取效果雖然不及高聚物/高聚物體系(一般為高聚物/高聚物體系的1/3 ～ 1/5),但其價格便宜,因此在酶的分離純化中應用較多。孟玲等[20]采用27%(m/m)PEG與13%(m/m)(NH4)2SO4萃取面粉中的植物酯酶,表明酶液的純化效果好。謝芳等[21]選擇30%(m/m)PEG及10%(m/m)(NH4)2SO4雙水相萃取技術分離提取生姜中生姜蛋白酶,結果表明該方法能快速純化生姜蛋白酶。Sarote Nitsawang等[22]利用8%(m/m)PEG/15%(m/m)(NH4)2SO4組成的雙水相體系從番木瓜乳漿中萃取木瓜蛋白酶,表明該方法能在較短的時間內獲得高純度的木瓜蛋白酶并且不會破壞酶的成分。因此PEG/鹽萃取體系相比于高聚物/高聚物體系成本低,在酶的純化方面應用前景廣闊,具有工業應用意義。

3.3本研究在確定PEG1000/(NH4)2SO4體系的基礎上,根據Box - Benhnken中心組合原理,以PEG濃度(m/m)(X1)、(NH4)2SO4濃度(m/m)(X2)和pH(X3)為自變量,以純化倍數(Y)為響應值進行三因素三水平共15個實驗點的響應面實驗。結合實際操作的可行性,最佳雙水相萃取麥麩酯酶工藝條件修訂為:21%PEG1000(m/m)、18%(NH4)2SO4(m/m)、pH4. 4。實驗結果純化倍數可達2. 9190。本實驗確立了PEG1000/(NH4)2SO4雙水相體系萃取麥麩酯酶的最佳條件,為麥麩酯酶的進一步研究奠定了基礎。

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