寬葉金粟蘭總黃酮的提取工藝及抗氧化活性研究

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(1. 廣西民族大學化學化工學院,廣西南寧 530006; 2. 廣西林產化學與工程重點實驗室,廣西南寧 530006; 3. 廣西民族大學海洋與生物技術學院,廣西南寧 530006)

寬葉金粟蘭(Chloranthushenryi)為金粟蘭科金粟蘭屬植物,又名四塊瓦、四大天王、大葉及己、四葉細辛等,產于陜西、甘肅、安徽、浙江、福建、江西、湖南、湖北、廣東、廣西、貴州、四川等地。全草入藥,味辛,性溫,有毒,具祛風除濕,活血散瘀,解毒的功效[1]。

藥理實驗研究表明金粟蘭屬植物多具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒、抗潰瘍、鎮痛、抗血小板聚集、收縮子宮等活性[2]。目前,研究者已從寬葉金粟蘭中分離出了萜類、香豆素類、甾體及甾體皂苷類等化學物質[3 - 5]。為了更好地開發寬葉金粟蘭,筆者對其地上部分,即其莖和葉進行了化學成分預實驗,發現其含有糖類、有機酸、黃酮類等化學物質。大多數天然黃酮類化合物都具有顯著的生理活性,如降血壓、降血脂,抗病毒、抗炎、抗氧化、抗菌等作用[6 - 8]。提取黃酮類化合物的方法有很多,最常用的方法有有機溶劑提取法、超聲波輔助提取法和微波輔助提取法等,而用微波輔助提取寬葉金粟蘭黃酮的文章幾乎未見報道。本研究采用微波輔助提取法對寬葉金粟蘭黃酮進行提取,并結合單因素實驗和正交實驗篩選出最佳的工藝條件。同時通過對寬葉金粟蘭黃酮提取物的還原力、DPPH自由基清除率及羥基自由基清除率的測定,對其抗氧化活性進行了評估,以期為寬葉金粟蘭的綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

寬葉金粟蘭 購于廣西玉林中藥材市場;蘆丁對照品,含量98%,批號100080 - 200707 購自中國食品藥品檢定研究院;其余試劑均為分析純;水為超純水。

UV - 1800島津紫外可見分光光度計 蘇州島津儀器有限公司;XH - MC - 1型祥鵠實驗室微波合成反應器 北京祥鵠科技發展有限公司;PL203電子天平 梅特勒 - 托利多儀器有限公司;SPS401F型電子天平 奧豪斯國際貿易有限公司;AJF - 1001 - U型基礎性純水器 艾科浦公司。

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 總黃酮提取 將寬葉金粟蘭洗凈烘干,粉碎并過60目篩,備用。取寬葉金粟蘭粗粉5. 0g,于500mL燒瓶中加入適量乙醇溶液,在60℃恒溫水浴中浸泡1h后,設微波溫度為60℃,在設定的實驗條件下(微波時間、微波功率、液料比和乙醇濃度等),采用微波輔助提取法提取寬葉金粟蘭中總黃酮。提取液經活性炭超聲脫色20min后,收集濾液,置于旋轉蒸發儀減壓濃縮,再用50%乙醇溶液溶解并定容于100mL的容量瓶中,作為樣品溶液待測。

1. 2. 2 標準曲線的繪制

1. 2. 2. 1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品18. 1mg,用50%乙醇溶液溶解,定容至100mL搖勻,配成0. 1810mg/mL的蘆丁對照品溶液,備用。

1. 2. 2. 2 測定波長的選擇 取對照品溶液5. 0mL置于25mL容量瓶中,加入5%的亞硝酸鈉溶液1. 0mL,搖勻,靜置6min,加入10%硝酸鋁溶液1. 0mL,搖勻,靜置6min,加入4%氫氧化鈉溶液10. 0mL,再加入50%乙醇溶液定容,搖勻,放置15min后,用紫外 - 可見分光光度計在400 ～ 600nm范圍內掃描。根據紫外吸收光譜圖確定檢測波長為510nm。

1. 2. 2. 3 標準曲線的繪制 精密量取0. 1810mg/mL的蘆丁對照品溶液0. 0、2. 0、4. 0、6. 0、8. 0、10. 0mL分別置于6個25mL的容量瓶中,按“1. 2. 2. 2”項下方法顯色后,在波長510nm下測定吸光度值,繪制標準曲線。

1. 2. 3 樣品總黃酮含量的測定 精密量取樣品溶液1. 0mL置于50mL容量瓶中,加入5%的亞硝酸鈉溶液2. 0mL,搖勻,靜置6min,加入10%硝酸鋁溶液2. 0mL,搖勻,靜置6min,加入4%氫氧化鈉試液20. 0mL,再加入50%乙醇溶液定容,搖勻,放置15min后在510nm處測定吸光值。利用回歸方程可計算出總黃酮含量。

1. 2. 4 單因素實驗 a. 精密稱取寬葉金粟蘭5份,按料液比1∶ 30,分別添加不同體積分數(40%、50%、60%、70%、80%)的乙醇溶液,60℃水浴浸泡1h,然后以400W的微波功率,60℃的微波溫度,處理15min。b. 精密稱取寬葉金粟蘭5份,按料液比1∶ 30添加60%乙醇溶液,60℃水浴浸泡1h,然后以不同的微波功率(200、300、400、500、600W),60℃的微波溫度,處理15min。c. 精密稱取寬葉金粟蘭6份,按料液比1∶ 30,添加60%乙醇溶液,在60℃水浴浸泡1h,然后以400W的微波功率,60℃的微波溫度,按不同時間(5、10、15、20、25、30min)處理。d. 精密稱取寬葉金粟蘭5份,分別按不同的料液比(1∶ 20、1∶ 30、1∶ 35、1∶ 40、1∶ 50)添加60%乙醇溶液,在60℃水浴浸泡1h,然后以400W的微波功率,60℃的微波溫度,處理10min。

1. 2. 5 正交實驗設計 根據單因素實驗結果,以不同乙醇體積分數(A)、微波功率(B)、微波處理時間(C)、料液比(D)為考察因素,寬葉金粟蘭總黃酮提取率為考察指標,選用L9(34)正交表設計,探討最佳提取工藝條件。各因素水平見表1。

1. 2. 6 抗氧化活性測定

1. 2. 6. 1 清除DPPH自由基能力的測定 參考文獻[9 - 11]，按最優工藝條件提取得的黃酮濃縮物,用50%乙醇溶液溶解并定容于100mL的容量瓶中,得到樣品溶液,測定其黃酮的質量濃度為6. 0mg/mL,再稀釋配制成含黃酮的質量濃度為0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8mg/mL的樣品溶液。在試管中依次加入0. 2mmol/L的DPPH乙醇溶液5. 0mL,再加入5. 0mL不同濃度的樣品溶液。振蕩器混勻后,室溫,避光放置30min后于517nm 下測定吸光度,計算清除率。

清除率(%)=[1 - (A1- A2)/A0]×100

接著，徐通理給他細細解釋“色即空，空即色”的處世哲學：他們把人生所需要的能看得見摸得著的東西都歸納為色，把無求無欲的崇高的為人道德歸納為空。人只有達到無求無欲這種“空”的境界，才能求得正果而獲得一切。如果只求“色”的東西，求來求去，越求反而離自己所需的東西越遠了。接著，老人又說，普通人大多一味地只求“色”的東西，這么一味地求下去，就叫作塵緣未了。

式中:A0為DPPH·溶液5. 0mL+無水乙醇5. 0mL的吸光值;A1為DPPH·溶液5. 0mL+樣品溶液5. 0mL的吸光值;A2為樣品溶液5. 0mL+無水乙醇5. 0mL的吸光值。

同法以相同濃度的VC做對照實驗,所有測定平行操作3次,取平均值。

1. 2. 6. 2 清除羥基自由基能力的測定 參考文獻[12 - 14]，在試管中分別加入2mL pH=7. 4的磷酸鹽緩沖液,0. 3mL 5mmol/L鄰二氮菲溶液,充分混勻后,加入0. 2mL 7. 5mmol/L 硫酸亞鐵溶液,每加一管后立即混勻。然后向其中加入不同黃酮質量濃度的樣品溶液,混勻,再加入1%的雙氧水1mL,最后補充體積至8mL。另再做損傷管和未損傷管,其中損傷管中加入1%的雙氧水1mL,未損傷管不加雙氧水,最后補充各管體積至8mL。于37℃下保溫1h,在536nm下測吸光值。同法以相同濃度的VC做對照實驗,每個實驗組重復3次,求得平均值,按下式計算清除率。

清除率(%)=(A樣- A損)/(A未損- A損)×100

式中:A未損為未損傷管的吸光值;A損為損傷管的吸光值;A樣為加樣品液的吸光值。

1. 2. 6. 3 還原能力的測定 參考文獻[15 - 17]，分別準確吸取2. 0mL不同黃酮質量濃度的樣品溶液,各加入0. 2mol/L pH6. 8磷酸緩沖液2. 5mL,再加1%的鐵氰化鉀溶液2. 5mL,50℃水浴20min后急速冷卻,加入10%的三氯乙酸溶液2. 5mL,于4000r/min離心10min,取上清液2. 5mL,加蒸餾水2. 5mL,0. 1%的三氯化鐵溶液0. 5mL,混合10min后于700nm波長處測定吸光度。以VC作為對照樣品,每組實驗重復3次后求得平均值,繪制總還原能力變化曲線。

2 結果與分析

2. 1 蘆丁標準曲線的繪制

以蘆丁質量濃度(x)為橫坐標,吸光度值(y)為縱坐標進行線性回歸,得回歸方程為y=11. 417x -0. 0078,R2=0. 9996;結果表明蘆丁在0. 01448 ～0. 07240mg/mL范圍內與吸光度值呈良好的線性關系。

2. 2 單因素實驗

2. 2. 1 乙醇體積分數對總黃酮得率的影響 由圖1可知,總黃酮的得率隨乙醇體積分數的增加而先上升后下降。當乙醇體積分數達到60%時,總黃酮得率最高,之后開始呈下降趨勢。分析其原因可能是因為物料中的水分子是主要的微波能吸收者,可以產生大量熱使物料升溫,隨著乙醇體積分數的增加,水的比例減少了,使物料升溫減慢從而影響了得率。另外高濃度乙醇使細胞內蛋白質凝固,黃酮不易溶出。因此,初步確定最佳乙醇體積分數為60%。

圖1 乙醇體積分數對總黃酮得率的影響Fig. 1 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids

2. 2. 2 微波功率對總黃酮得率的影響 由圖2可知,黃酮的得率隨微波功率的增加而逐漸提高,當微波功率達到400W時,總黃酮提取率達到最大值,之后隨著微波功率的增加,含量呈下降趨勢。分析其原因,微波功率增大,對細胞的破壞力增強,細胞的溶出物增多,黃酮得率增高。但微波功率過高,會造成樣品中細胞內蛋白質變性,從而影響黃酮類物質的溶出。因此,最佳微波功率選定400W。

圖2 微波功率對提取效果的影響Fig. 2 Effect of microwave power on extraction

2. 2. 3 微波處理時間對總黃酮得率的影響 由圖3可知,黃酮的得率隨微波作用時間的增加而提高,當微波處理時間達到10min時,總黃酮得率最高,之后隨著微波處理時間的增加,呈下降趨勢。這可能是在一定的功率下微波時間越長,溫度越高,對細胞的破壞就越完全,溶出物也越多,得率呈上升趨勢。 但過長的微波時間會導致部分黃酮受熱變質,黃酮得率反而下降。因此,最佳微波處理時間初步選定10min。

圖3 微波處理時間對提取效果的影響Fig. 3 Effect of microwave time on extraction

2. 2. 4 料液比對總黃酮得率的影響 由圖4可知,當料液比達到1∶ 30時,總黃酮得率最高,之后隨著溶劑的增加,含量呈下降趨勢。這是由于增加溶劑量有利于黃酮的溶出,但繼續加大溶劑量會影響提取體系的傳熱和傳質,從而影響黃酮的提取。因此,最佳料液比選定1∶ 30。

圖4 料液比對總黃酮得率的影響Fig. 4 Effect of solid to liquid ratio on extraction

2. 3 正交實驗

2. 3. 1 正交實驗結果 正交實驗和方差分析結果見表2和表3,由極差分析可知各因素對寬葉金粟蘭總黃酮提取率的影響大小順序依次為:A>C>D>B,即乙醇體積分數和微波處理時間影響最大,微波功率影響最小;方差分析表明A因素和C因素具有顯著性,是影響提取效果的重要因素。故最佳提取條件為:A3B2C2D2,即乙醇體積分數為60%、微波功率為300W、微波處理時間為15min、料液比為1∶ 30。

表2 正交實驗結果Table 2 The results of orthogonal test method

表3 方差分析結果Table 3 The results of variance analysis

注：F0.05(2,2)=19. 0；F0.01(2,2)=99. 0。

2. 3. 2 驗證實驗 按照正交實驗獲得的最優組合:即乙醇體積分數為60%、微波功率為300W、微波處理時間為15min、料液比為1∶ 30,進行微波輔助提取實驗,重復5次平行操作,其總黃酮的平均得率是6. 11%。結果優于正交實驗中的最高得率,表明通過正交實驗研究達到了優化目的。

2. 4 寬葉金粟蘭總黃酮體外抗氧化能力

2. 4. 1 清除DPPH自由基的能力 從圖5 可以看出,隨著樣品質量濃度的增加(由0. 2 ～ 0. 8 mg/mL),寬葉金粟蘭黃酮對DPPH自由基的清除率從72. 4% 增加到76. 2%。與同等質量濃度的VC相比較,寬葉金粟蘭黃酮對DPPH自由基的清除率略低于VC的清除率。在實驗濃度范圍內,VC對自由基的清除率在77. 8% ～ 85. 3%范圍內。

圖5 寬葉金粟蘭黃酮提取物和抗壞血酸對DPPH自由基的清除作用Fig. 5 Scavenging effect of extract and VC on DPPH radical

2. 4. 2 清除羥基自由基的能力 由圖6可知,兩者對清除羥基自由基均有較好的量效關系。當提取物的濃度由0. 2mg/mL 增加至0. 8mg/mL 時,其對羥基自由基的清除率由2. 23% 上升到 100%。在小于0. 5mg/mL的質量濃度下,寬葉金粟蘭黃酮的清除羥基自由基能力低于VC;質量濃度大于0. 5mg/mL時清除能力呈逐漸增強趨勢,寬葉金粟蘭黃酮的清除羥基自由基能力明顯高于VC。

圖6 寬葉金粟蘭黃酮提取物和抗壞血酸對羥自由基的清除作用Fig. 6 Scavenging effect of extract and VC on hydroxyl free radical

2. 4. 3 還原力 由圖7可知,反應體系中,寬葉金粟蘭黃酮提取物的樣品溶液與VC的吸光度都隨質量濃度的增加而增大,在0. 2 ～ 0. 5mg/mL的濃度下,兩者的還原能力接近且具有相似的上升趨勢;0. 6mg/mL的濃度下兩者還原能力有較大差距;0. 7 ～ 0. 8mg/mL的濃度下還原能力又趨于接近。說明寬葉金粟蘭黃酮提取物具有較強的還原能力。

圖7 寬葉金粟蘭黃酮提取物和抗壞血酸的還原能力Fig. 7 Reducing power of extract and VC

3 結論

3.1本文采用微波輔助提取法探索了各單因素對寬葉金粟蘭中總黃酮得率的影響,并進行了正交實驗。結果表明,微波輔助提取寬葉金粟蘭總黃酮的最佳工藝條件為:乙醇體積分數60%、微波功率300W、微波處理15min、料液比為1∶ 30。在上述最佳工藝條件下進行驗證實驗,得到總黃酮得率為6. 11%,結果高于正交實驗中的最高提取率,表明通過正交實驗研究達到了優化目的。微波提取法操作簡單,可以極大地縮短提取時間,且能達到較高的提取效率,是一種較為理想的提取寬葉金粟蘭總黃酮的方法。

3.2體外抗氧化活性實驗表明,寬葉金粟蘭總黃酮具有很強的自由基清除力和還原能力,在一定范圍內,清除效果隨著質量濃度的升高而加強,具有明顯的量效關系。在實驗濃度(0. 2 ～ 0. 8mg/mL)范圍內,寬葉金粟蘭黃酮對羥基自由基的清除率可達到100%,對DPPH自由基的清除率可達到76. 2%。與VC相比,寬葉金粟蘭黃酮提取物對DPPH自由基的清除能力略低于同質量濃度的VC,但其黃酮提取物對羥基自由基的清除能力與同質量濃度的VC相當,甚至在質量濃度較高時,超過VC。這可能是因為金粟蘭黃酮提取物對不同的自由基表現的敏感性不同。同時,金粟蘭黃酮提取物還有與VC相當的還原能力。總的來說,寬葉金粟蘭黃酮提取物具有較強的抗氧化活性,這預示著它在醫學和人類保健事業上有著潛在的利用價值,具有一定的開發和應用前景。

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