大豆多糖對環磷酰胺抗腫瘤作用的減毒增效機制研究

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(1. 哈爾濱商業大學生命科學與環境科學研究中心生物安全評價研究所,國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心,黑龍江哈爾濱 150076; 2. 哈爾濱商業大學藥學院,黑龍江哈爾濱 150076; 3. 黑龍江省農業科學院 食品加工研究所,黑龍江哈爾濱 150086)

《本草綱目》記載,大豆有涂癰腫、逐水脹、長肌膚、填骨髓等作用。從豆渣中提取的可溶性大豆多糖具有許多生物學功能,目前主要用于食品行業的研究與應用,本課題組經過研究發現大豆多糖能增強荷瘤小鼠B淋巴細胞和T淋巴細胞的免疫功能,調節機體免疫功能抑制腫瘤細胞的生長[1 - 2]。且大豆多糖為植物中提取的活性物質本身無毒、安全,有一定的生物學作用[3 - 5]。

環磷酰胺為臨床常用的廣譜抗腫瘤藥物,由于其對造血系統和免疫系統的毒副作用不利于機體的繼續治療與術后的恢復[6 - 8],已有研究表明大豆多糖能通過提高機體免疫力,起到抗腫瘤作用,本研究將大豆多糖和環磷酰胺聯合應用,腋下接種S180肉瘤的KM小鼠為載體,研究其對荷瘤機體免疫系統和造血系統的影響,以期既能夠開發臨床抗腫瘤輔助用藥,又能為環磷酰胺的安全使用提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

昆明種小鼠,18 ～ 22g,雌、雄各半 由長春高新醫學實驗動物研究中心提供;肉瘤S180購自哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院;大豆多糖(純度95%) 上海百奧特植物蛋白科技有限公司;環磷酰胺(CP) 江蘇恒瑞醫藥有限公司;Anti - mouse - FITC - CD4單克隆抗體、Anti - mouse - PE - CD8單克隆抗體 美國ebioscience公司;小鼠腫瘤壞死因子 - αELISA 檢測試劑盒 美國R&D公司等。

ALC - 110. 4型萬分之一電子天平 德國Sartorius Group;LD4 - 2A型臺式低速離心機 北京醫用離心機廠;普通光學顯微鏡 Leica公司;SUNRISE 酶標儀 TECAN公司;EPICS - XL - MCL流式細胞儀 美國Beckman - Coulter公司等。

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 動物分組與給藥 昆明種小鼠50只,將接種8d的S180肉瘤腹水5mL,生理鹽水1∶ 3稀釋,0. 2mL/只接種于小鼠右前肢腋下。24h后隨機分成5組,每組10只,雌雄各半。從接種第二天開始,分別腹腔注射給藥,分為陰性對照組:同體積生理鹽水;環磷酰胺(CP)對照組:25mg/(kg·d);大豆多糖(soybean polysaccharide,SPS)聯合環磷酰胺治療組A:CP 25mg/kg·d+SPS 50mg/kg·d、B:CP 25mg/(kg·d)+SPS 100mg/(kg·d)、C:CP 25mg/(kg·d)+SPS 200mg/(kg·d);給藥量為0. 2mL/只/d,連續給藥10d,停藥次日處死動物。

1. 2. 2 白細胞懸液制備 停藥次日,試管內加2%的乙酸0. 38mL,取0. 02mL尾靜脈血,充分裂解紅細胞,顯微鏡下觀察外周血白細胞數量。

1. 2. 3 脾淋巴細胞制備 收集脾細胞于離心管中,以1500r/min離心10min。10倍體積0. 83%的NH4Cl溶液重懸,靜置4min,裂解紅細胞,1000r/min離心5min得白細胞液。Hanks液洗,pH為7. 2 ～ 7. 4的PBS稀釋細胞成1×106個/mL。

1. 2. 4 小鼠血清中TNF - α的檢測 眼球取血,1000r/min離心10min,取50μL加生物素標記抗體50μL。37℃溫育1h。加親和鏈酶素 - HRP 60μL,37℃溫育30min。每孔加入底物A和底物B各50μL,37℃溫育10min。450nm波長處測定各孔的OD值。以TNF - α標準品濃度為橫坐標(X),相應的OD值為縱坐標(Y),繪制標準曲線,并計算各樣品中的TNF - α含量。

1. 2. 5 T淋巴細胞亞群的測定 取1×106個細胞1mL,2000r/min離心5min,分別加入熒光標記的抗小鼠CD4、CD8的單克隆抗體各100μL,同時設空白對照組和單加CD4、CD8抗體的對照組。4℃避光30min,加1mL PBS緩沖液洗滌,2000r/min離心5min,1% 多聚甲醛1mL固定30min,200目過濾,流式細胞儀檢測。

2 結果與分析

2. 1 大豆多糖聯合環磷酰胺對S180荷瘤小鼠外周血中白細胞數量的影響

由表1可以看出,環磷酰胺顯著(p<0. 01)降低了荷瘤小鼠血液中的白細胞數量,與環磷酰胺組相比,大豆多糖各劑量組白細胞數量均有極顯著(p<0. 01)上升。

表1 大豆多糖聯合環磷酰胺對S180荷瘤小鼠外周血中白細胞數量的影響Table 1 The effect of SPS with CP on WBC of mice

注:與對照組比較*p<0. 05,* *p<0. 01;與CP比較#p<0. 05;##p<0. 01。

2. 2 大豆多糖聯合環磷酰胺對S180荷瘤小鼠血清中TNF - α含量的影響

TNF - α標準曲線方程:y=0. 002x+0. 118,R2=0. 993

圖1 TNF - α標準曲線Fig. 1 Standard curve of TNF - α

如表2所示,與對照組相比,環磷酰胺組TNF - α水平下降,差異極顯著(p<0. 01),聯合用藥各劑量組TNF - α含量均有所提高,其中低劑量組統計學無意義(p>0. 05),中、高劑量組有極顯著性差異(p<0. 01)。與環磷酰胺組比較,低劑量組有差異(p<0. 05),中、高劑量組有極顯著性差異(p<0. 01)。

2. 3 大豆多糖聯合環磷酰胺對S180荷瘤小鼠 T 淋巴細胞亞群的影響

表2 大豆多糖聯合環磷酰胺對S180荷瘤小鼠血清TNF - α含量的影響Table 2 The effect of SPS with CP on TNF - α in serum of mice with tumor

圖2 大豆多糖聯合環磷酰胺對S180荷瘤小鼠T淋巴細胞亞群作的影響Fig. 2 The effect of SPS with CP on and of T lymphocyte subsets注:a:對照組;b:環磷酰胺組;c:低劑量組;d:中劑量組;e:高劑量組。

3 討論

腫瘤治療主要根據腫瘤細胞和正常細胞不同的代謝特征、生物學特征、基因特征進行的,如果只強調治療腫瘤的個性,忽視共性和整體原則就會影響治療效果。如化療及放療藥物在殺死腫瘤細胞的同時也損壞機體的免疫功能,使殘存的腫瘤細胞急劇繁殖,影響治療效果。臨床觀察表明惡性腫瘤的發生發展,患者對治療措施的療效和存活期與機體的免疫狀態有密切關系。因此通過提高機體的免疫功能增強機體抗腫瘤作用的治療方法也越來越重要。天然多糖作為免疫調節劑由于本身對機體的毒副作用小,增強機體免疫力等優點受到人們的密切關注[9]。 造血系統是體內高度活躍和高度新陳代謝的系統,由于血細胞的生成主要是在骨髓造血組織中進行,因此血細胞的變化能夠一定程度的反映骨髓造血系統的變化。環磷酰胺可導致機體外周血白細胞數量減少,T細胞異?；罨?使免疫功能低下,是化療藥物骨髓抑制的表現[10]。TNF - α能夠引起腫瘤組織血管損傷和血栓形成,繼而使腫瘤組織發生出血、壞死,并能夠促進T細胞及其它殺傷細胞對腫瘤細胞進行殺傷。

4 結論

[1]張秀娟,劉斌,孫宇婷,等. 大豆多糖對S180荷瘤小鼠抗腫瘤作用的免疫機制研究[J]. 食品工業科技,2012,33(2):389 - 392.

[2]張秀娟,孫向菊,嚴松,等. 大豆多糖對S180荷瘤小鼠免疫調節作用的研究[J]. 藥物評價研究,2012,35(6):420 - 422.

[3]廖勁松. 可溶性大豆多糖的性質及其在冷凍冷藏食品中的應用[J]. 中外食品,2010(1):51 - 52.

[4]Champ M,Guillon F. Structural and physical properties of dietary fibers,and consequences of processing on human physiology[J]. Food Research International,2000,33:233 - 245.

[5]張樹和,韓羿斌,金雙喜,等. 大豆多糖對雙歧桿菌及人腸道菌群生長的影響[J]. 中國微生態學雜志,2008,20(2):135 - 136.

[6]王聰,王一騰,魏鑫. 環磷酰胺的臨床應用現狀[J]. 臨床和實驗醫學雜志,2008,7(8):179 - 181.

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[8]韋鳳華. 環磷酰胺的臨床應用研究進展[J]. 中國藥事,2013,27(3):324 - 326.

[9]林俊,李萍,陳靠山. 近五年多糖抗腫瘤研究進展[J]. 中國中藥雜志,2013,38(8):1116 - 1120.

[10]饒子亮,鄭佳琳,黃威,等. H22實體瘤小鼠的免疫功能指標及環磷酰胺的影響[J]. 實驗動物科學,2013,30(3):10 - 15.