發光二極管熒光顯微鏡檢測結核分枝桿菌在基層實驗室的應用評價

宋媛媛 蔣明霞 郭占清 夏輝 趙雁林

在我國基層結核病實驗室使用萋-尼(Ziehl-Neelsen，Z-N)抗酸染色方法對痰涂片進行染色，應用普通光學顯微鏡檢測結核分枝桿菌仍然是診斷肺結核的常規方法。此檢測方法成本低廉、操作簡單、特異度較高，但其缺點是敏感度較低。而通過熒光染色，普通熒光顯微鏡檢測結核分枝桿菌較普通光學顯微鏡敏感度能提高8%，且特異度與普通光學顯微鏡相當[1]。但普通熒光顯微鏡價格昂貴，且需要維修費用及暗室條件，限制了在我國的應用。發光二極管(light emitting diodes，LED)熒光顯微鏡可以很好地解決這些問題，并且很多研究也顯示其具有很好的應用價值[1-5]。2011年7月至2011年9月筆者在青海省西寧市7個縣(區)級結核病防治機構(簡稱“結防機構”)研究LED熒光顯微鏡在我國基層結核病實驗室檢測痰涂片中結核分枝桿菌的應用效果，現將結果報告如下。

材料和方法

一、試劑和材料

研究過程中，各縣(區)級結防機構使用由省級結核病參比實驗室統一配發的染色液。傳統光學顯微鏡為奧林巴斯CX21FS1-2，使用100倍物鏡觀察痰涂片。LED熒光顯微鏡為蔡司公司Primo star iLED, 應用20倍物鏡觀察痰涂片。

二、研究對象

研究階段(2011年7月至2011年9月)連續收集西寧市的城東區、城中區、城西區、城北區、大通縣、湟源縣、湟中縣7個縣(區)級結防機構就診的初診肺結核可疑癥狀者，共納入592例(1738份痰標本)。有6.42%(38/592)的患者收集到2份痰標本，93.58%(554/592)的患者收集到3份痰標本。

三、試驗方法

每份痰標本制作2張涂片，在不同實驗室由1名實驗人員根據國家規劃要求采用萋-尼染色和熒光染色，并分別用傳統光學顯微鏡和LED熒光顯微鏡檢測,操作方法參見文獻[6]。每份痰標本同時由省級結核病參比實驗室進行簡單法固體羅氏培養，試驗方法參見文獻[7]。

四、統計學分析

所有數據由國家結核病參比實驗室審核后，雙人雙錄入專門建立的EpiData數據庫中，用SAS 9.2軟件進行統計學分析。用配對χ2檢驗比較應用兩種顯微鏡檢測痰標本中結核分枝桿菌的陽性檢出率；用ROC曲線下面積評價兩種顯微鏡診斷肺結核的價值。完全無價值的診斷試驗曲線下面積為0.5，理想的診斷試驗曲線下面積為1，而一般認為對于一個診斷試驗，ROC曲線下面積在0.5～0.7之間時診斷價值較低，在0.7～0.9之間時診斷價值中等，在0.9以上時診斷價值較高[8]；用t檢驗對檢出時間的差異進行統計學分析,P<0.05認為差異有統計學意義。

五、質量控制

在研究工作正式開始前對所有操作人員開展為期1周的培訓，并經熟練度測試合格后試運行1個月，然后正式開始研究。各研究點統一使用由省級配制的染色液，染色液發放之前已經通過質量控制合格。對于同一張涂片的兩種鏡檢方法采用盲法進行操作。培養基由省級結核病參比實驗室自行配制，經過無菌測試合格后使用。

結 果

一、傳統光學顯微鏡與LED熒光顯微鏡兩種方法對痰涂片的陽性檢出率比較

傳統光學顯微鏡和LED熒光顯微鏡的涂片陽性檢出率分別為13.75%(239/1738)和14.90%(259/1738)，后者較前者提高1.15個百分點，兩種鏡檢方法的陽性檢出率差異有統計學意義(Z=5.88，P<0.05)。

二、傳統光學顯微鏡與LED熒光顯微鏡兩種方法對診斷肺結核患者的價值比較

培養是細菌學診斷結核病的金標準，因此研究中對每份痰標本都做了簡單法固體羅氏培養試驗，共計1738份，其中有2份培養污染，不計入分析。以培養結果為金標準，進一步分析傳統光學顯微鏡和LED熒光顯微鏡鏡檢結果的準確性，傳統光學顯微鏡敏感度為79.60%(199/250，95%CI=74.60%～84.60%)，特異度為97.31%(1446/1486，95%CI=96.49%～98.13%)。LED熒光顯微鏡敏感度為84.80%(212/250， 95%CI=80.30%～89.25%),特異度為96.84%(1439/1486， 95%CI=95.95%～97.73%)(表1)。

每份痰標本兩種顯微鏡的鏡檢結果分別與培養結果比較繪制診斷肺結核患者的ROC曲線(圖1，2)。從表2可見，用傳統光學顯微鏡診斷肺結核患者時ROC曲線下面積為0.8878(95%CI=0.8623～0.9133)，與完全無價值的診斷試驗曲線下面積0.5相比差異有統計學意義(Z=29.8308,P<0.01)；LED熒光顯微鏡ROC曲線下面積為0.9118(95%CI=0.8890～0.9347)，與0.5相比差異有統計學意義(Z=35.1966,P<0.01)。傳統光學顯微鏡和LED熒光顯微鏡兩種鏡檢方法均具有中高度的診斷價值，LED熒光顯微鏡具有更高的診斷價值。對兩種方法的曲線下面積進行比較，差異有統計學意義(χ2=4.4236，P<0.05)，即兩種方法的診斷價值差異有統計學意義。

三、傳統光學顯微鏡和LED熒光顯微鏡讀片時間分析

比較兩種鏡檢方法在閱讀不同級別涂片所花費的時間(表3)，成組分析兩種方法的讀片時間可見，LED熒光顯微鏡的平均讀片時間明顯短于傳統光學顯微鏡，兩者差異有統計學意義(t=15.32,P<0.01)，除結果為實際細菌條數的涂片外，其他各陽性級別涂片兩種方法的讀片時間差異均有統計學意義(P<0.01)。

表2 傳統光學顯微鏡和LED熒光顯微鏡診斷肺結核患者的ROC曲線下面積

圖1 傳統光學顯微鏡診斷肺結核患者的ROC曲線

圖2 LED熒光顯微鏡診斷肺結核患者的ROC曲線

表3不同鏡檢結果采用傳統光學顯微鏡與LED熒光顯微鏡的讀片時間比較

鏡檢結果標本量(份)讀片時間(s，x±s)傳統光學顯微鏡LED熒光顯微鏡傳統光學顯微鏡LED熒光顯微鏡t值雙側近似P值陰性12161133186 100±73 779150 000±57 62513 230<0 011～8條/300視野、1～9條/50視野2536261 320±169 851207 420±69 5101 502>0 05陽性+6656217 620±114 705157 000±53 4143 832<0 01陽性++5942149 120±35 785113 740±55 4743 630<0 01陽性+++3052147 200±57 54472 020±36 2086 456<0 01陽性++++2149117 800±82 38350 330±38 9023 586<0 01合計14171368185 600±79 271144 190±62 17315 320<0 01

討 論

本研究中評價了傳統光學顯微鏡與LED熒光顯微鏡兩種鏡檢方法對痰涂片的陽性檢出率差異，據文獻[1,3,9-12]報道LED熒光顯微鏡比傳統光學顯微鏡陽性檢出率增加值范圍多數在0%～33%，其中一篇系統的回顧性研究中得出陽性檢出率平均增加值為9%(95%CI=5%～13%),差異有統計學意義[1]。本研究結果顯示LED熒光顯微鏡比傳統光學顯微鏡涂片陽性檢出率提高1.15個百分點。兩種鏡檢方法的總體檢出率差異有統計學意義(Z=5.88，P<0.05)，與文獻[1,3,9-12]研究結果相符。

以簡單法固體羅氏培養結果為金標準，進一步分析傳統光學顯微鏡、LED熒光顯微鏡檢測結果的準確性。有學者研究表明LED熒光顯微鏡比傳統光學顯微鏡敏感度最多提高到39.32%，最低降低到9%；特異度最多提高到1.00%，最多降低到8.4%[2-4,9,12-13]；其中一篇系統的回顧性研究中得出敏感度平均增加8%,特異度平均無變化，為0%[1]。本研究得出的結果與文獻[1-4，9,12-13]結果一致。因此，可得出“LED熒光顯微鏡診斷肺結核較傳統光學顯微鏡有更高的敏感度，而特異度相當”。

每份痰標本兩種顯微鏡的鏡檢結果分別與培養結果進行比較繪制診斷肺結核患者的ROC曲線，傳統光學顯微鏡和LED熒光顯微鏡兩種鏡檢方法均具有中高度的診斷價值，LED熒光顯微鏡具有更高的診斷價值，兩種方法的診斷價值差異有統計學意義(χ2=4.4236，P<0.05)。因此，LED熒光顯微鏡替代傳統光學顯微鏡可以提高診斷肺結核的價值。

LED熒光顯微鏡較傳統光學顯微鏡讀片時間明顯縮短(節省22.31%時間)。但同時需要注意的是，國際上推薦用傳統光學顯微鏡平均讀片時間為5～10 min[14]，但實際我國基層實驗室工作量大，工作人員熟練程度高，他們的讀片時間一般在2～5 min。有研究表明，如果用10 min的時間重新觀察陰性涂片，會提高50%的陽性檢出率[15]。但是如果每張涂片觀察10 min，在我國基層實驗室難以實現。本研究中使用傳統光學顯微鏡的平均讀片時間為185.6 s，讀片時間較短也是導致各實驗室陽性檢出率低的一個因素。考慮到實驗室人員使用LED熒光顯微鏡時間較短，熟練程度還不夠高，這也對讀片時間差異有一定影響。對于工作負荷重的實驗室，使用LED熒光顯微鏡可以節約人力時間，減輕工作負荷。

從本研究結果可以看出，LED熒光顯微鏡與傳統光學顯微鏡相比較，痰涂片陽性檢出率明顯提高，且具有更高的敏感度，但特異度相當，診斷肺結核患者的價值更高，讀片時間明顯縮短。使用LED熒光顯微鏡對人員教育背景、工作經驗等無特殊要求，現有的從事實驗室鏡檢的工作人員經過培訓并熟練掌握后均可以開展工作。生物安全要求與現有涂片鏡檢方法相同，維護成本較低。但在推廣使用時應對實驗人員掌握的熟練程度情況予以重視，并需完善現有的熒光涂片質量控制體系，以便更好地開展盲法復檢工作。LED熒光顯微鏡在我國基層實驗室有一定的推廣和應用價值，建議推廣使用前進行擴大樣本量研究，并做相應的經濟學評價。

志謝感謝青海省疾病預防控制中心、西寧市疾病預防控制中心及西寧市七縣(區)疾病預防控制中心結核病實驗室工作人員在研究現場的辛勤工作！

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