肥胖對雌性大鼠交感腎上腺系統的長期程序化作用

吳雪清， 楊思蒙， 李月華， 周強勇， 陳海燕， 李海鷹

（溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江 溫州 325015；1.婦科；2.心內科）

·論 著·

肥胖對雌性大鼠交感腎上腺系統的長期程序化作用

吳雪清1， 楊思蒙1， 李月華1， 周強勇1， 陳海燕1， 李海鷹2

（溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江 溫州 325015；1.婦科；2.心內科）

目的：研究肥胖對雌性大鼠交感腎上腺系統的長期程序化作用。方法：將雌性SD大鼠在出生當日分成2組：①實驗組，小窩喂養，每窩4只；②對照組，正常喂養，每窩12只。每周測體質量，出生后28 d開始監測陰道口初開放時間和陰道細胞學涂片。出生后10周，用免疫組織化學方法測定腎上腺和卵巢交感神經興奮性的改變；用原位雜交技術測定中樞藍斑核的酪氨酸羥化酶（TH）mRNA的表達變化。結果：與對照組相比，實驗組動物明顯肥胖，持續終生；青春期啟動明顯提早[實驗組（35.5±0.8）d，對照組（37.6±0.3）d]；卵巢和腎上腺的TH免疫染色明顯增強和藍斑核的TH mRNA表達明顯增加，其差異均有統計學意義（均P＜0.05）。結論：肥胖通過上調交感腎上腺興奮性影響雌鼠的生殖功能。

肥胖；腎上腺；卵巢；生殖功能；交感神經；大鼠

隨著現代生活水平的提高，肥胖，尤其是青春期肥胖的發病率急劇上升。研究表明在人類，肥胖往往伴隨著青春期發育提前[1]和下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸的高反應性，基礎或應激狀態下促腎上腺皮質激素（ACTH）和可的松分泌增加[2]。因此，研究早期肥胖對生殖功能和交感腎上腺系統的影響尤顯重要。但目前鮮見小窩喂養大鼠的動物模型來研究肥胖和交感腎上腺功能異常關系的報道。本研究的目的是探討早期肥胖對雌鼠外周及中樞交感腎上腺系統的長期程序化作用。

1 材料和方法

1.1 動物模型普通級孕晚期的SD大鼠由溫州醫科大學實驗動物中心提供。置于該中心標準的動物房（12 h光照，12 h黑暗，光照開始于早上7時，溫度（22±2）℃，給予標準動物食物和飲水。在幼鼠出生當天（D0），稱健康幼鼠體質量，并將幼鼠數目調整為4只/窩（實驗組）和12只/窩（對照組）。所有的幼鼠都在出生后21（D21）天斷奶。然后4～6只幼鼠置于同一窩中直到實驗結束。本實驗經過溫州醫科大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 監測青春期啟動和卵巢周期：從出生后28 d開始每天觀測動物的陰道口初開放（為大鼠的青春期啟動的標志）。一旦陰道口開放，即稱體質量，開始每日行陰道涂片，連續2個排卵周期。正常的卵巢周期指的是連續2個排卵周期正常（持續4～5 d，雌激素相1～2 d）。同時每周稱動物體質量。

1.2.2 免疫組織化學方法測定卵巢和腎上腺的免疫染色強度：在出生后10周時，行卵巢和腎上腺切除術。將其制成蠟塊，并以4μ m的厚度切片，先在xylene、乙醇脫水，在0.3% Triton X-100溶液里孵化，用0.3% H2O2抑制內源性過氧化酶。然后，待檢組織先與大鼠抗酪氨酸羥化酶（TH）第一抗體（1: 1 500卵巢；1:1 000腎上腺）在4 ℃孵化（36 h卵巢；60 h腎上腺），然后與第二抗體（山羊抗大鼠IgG）1:300卵巢及1:400腎上腺室溫下孵化60 h，再與第三抗體生物素-辣根過氧化酶（ABC復合物；1:200）室溫下孵化45 h，最后用DAB染色觀察其免疫反應性強弱，棕黃色染色為陽性。實驗中陰性對照為鄰近的切片以不含第一抗體的非免疫血清孵化；陽性對照為大鼠腎上腺。批間差異的控制用來自于同一卵巢的已知免疫強度的兩片切片組織加入每批免疫組織化學實驗中。免疫染色強度的測定使用半定量的H-score方法[3]進行評分，由兩個獨立的不知道組別的實驗者在Zeiss顯微鏡成像系統下完成。

1.2.3 原位雜交法測定藍斑核TH mRNA水平：在出生后10周時，取腦組織，15μ m厚度連續切片（Bright冰凍切片機），收集藍斑核所在組織，保存于-70 ℃待檢。用TH cDNA探針對收集的藍斑核切片行原位雜交。按照說明書要求對切片進行常規預處理后、每張切片滴加25μL預雜交液，恒溫箱內預雜交2 h，按每張切片25μL滴加含有TH寡核苷酸探針的雜交液，50 ℃恒溫箱內雜交過夜，次日常規洗片，晾干。陰性對照用預雜交液代替TH寡核苷酸探針的雜交液進行雜交，其余步驟均相同。然后將切片置入膠片盒，并蓋上BioMax MR-1膠片，密閉至于暗室內4 d。然后對膠片進行清洗，定影、顯影，共4周。將顯影后的膠片用連于光學顯微鏡20倍的數碼相機拍攝，使用Scion Image影像分析系統進行形態學分析，并對藍斑核區域內的TH mRNA陽性細胞進行計數和平均灰度值（RA）檢測，取4～5片平均值代表一個動物的藍斑核的RA。

1.3 統計學處理方法采用SPSS17.0統計軟件，所有數據以±s表示。陰道口初開放時間和體質量差異比較采用一次方差分析和Dunnett-t檢驗；TH的免疫染色強度的測定使用半定量的H-Score方法[3]，數據以H-評分±標準差表示。TH mRNA的表達使用二次方差分析和Dunnett-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小窩喂養對雌鼠體質量的影響小窩喂養，即實驗組大鼠較對照組體質量明顯增加，且持續到成年（P＜0.05），見圖1。

圖1 小窩喂養對大鼠體質量的影響

2.2 小窩喂養對雌鼠生殖功能的影響陰道口初開放時間在實驗組為（35.5±0.8）d，對照組為（37.6±0.3）d，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗組正常卵巢周期數為37.8%，對照組為66.7%，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 肥胖對卵巢交感神經興奮性的影響TH在卵巢中的免疫染色分布于卵泡膜細胞和間質組織。TH免疫染色強度在實驗組為（2.74±0.20）分，對照組為（1.08±0.06）分，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

2.4 肥胖對腎上腺交感神經興奮性的影響TH在腎上腺的免疫染色局限在髓質。TH免疫染色強度在實驗組的腎上腺髓質為（3.78±0.40）分，對照組為（1.54±0.30）分，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖2 早期肥胖對大鼠卵巢組織中TH免疫染色的影響（ABC，×200）

圖3 早期肥胖對大鼠腎上腺組織中TH免疫染色的影響

2.5 肥胖對藍斑核TH mRNA表達的影響TH mRNA在實驗組和對照組的藍斑核核團均有表達。實驗組為（350.20±12.34）RA，對照組為（240.80 ±10.42）RA，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

已經知道，青春期的啟動時間是和機體的營養和代謝狀態緊密相關的。本實驗證明了早期肥胖能加速大鼠青春期的發育，可能是實驗組大鼠的高瘦素分泌導致了其青春期發育的提早。有研究提出瘦素可能是下丘腦kisspeptin系統關鍵的調節因子，參與生殖軸的代謝調控[4]。已經知道kisspeptin是青春期的啟動因子，因此青春期前后實驗組大鼠的下丘腦kisspeptin及其基因和受體表達，有待于進一步研究。在卵巢水平，其交感神經興奮性（TH免疫反應性）增加也是生殖功能異常的一個機制。有報道指出異常增加的卵巢交感神經興奮性往往出現在卵巢周期異常、排卵減少和多囊卵巢改變之前[5]。

交感神經系統和腎上腺髓質組成了交感腎上腺系統，受發育早期的環境影響，包括營養。新生兒時期暴露于寒冷環境導致永久棕色脂肪組織交感支配和交感神經興奮性增加[6]；新生兒時期的免疫應激導致長期的外周交感神經興奮性升高[7]；反之，新生兒撫觸減少成年雄性大鼠脾臟和心臟的交感神經興奮性[8]。TH，兒茶酚胺生物合成的限速酶，在本研究中其免疫染色在肥胖組大鼠的腎上腺髓質表達明顯增強。已經知道，嗜鉻細胞的成熟有賴于早期發育時期的營養狀況。交感腎上腺系統在遺傳性肥胖和下丘腦性肥胖[9]大鼠亦是異常增高的。

肥胖往往使得交感腎上腺興奮性基礎閾值增加，導致對應激后的反應減弱[10]。給大鼠喂養高脂飲食導致心臟和棕色脂肪組織的交感興奮性增加，而饑餓或限制能量攝入導致這些組織交感興奮性受抑制。同樣，在人類，也有類似表現。在大鼠和人類觀察到的肥胖交感神經興奮性增加是由于廣泛的脂肪儲存在脂肪組織，產生激素信號，包括瘦素和胰島素。這些激素可以到達下丘腦，導致自主輸出的改變，尤其是增加交感神經興奮性[11]。給大鼠靜脈輸注瘦素，使其血漿水平達到人類嚴重肥胖水平，可以使血壓和心率增加，由此證明瘦素可能是肥胖和增加的交感神經興奮性的重要因素[12]。

為了驗證，本研究除了檢測卵巢和腎上腺組織的交感神經興奮性外，還測定了交感神經中樞—藍斑核的TH mRNA的水平。結果顯示小窩喂養組大鼠其藍斑核中TH mRNA表達較正常喂養組明顯增加。這表明了中樞交感神經系統興奮性基礎水平的上調。在該模型中，增加的胰島素和瘦素可能起到作用[13]。成年期增加的交感神經性可能解釋了發育起源的疾病，由于交感興奮性增加如成年后發病的高血壓，在這個模型中已經體現。對大鼠喂養高脂飲食，可使其血壓進行性升高，并且和體質量相關，進一步證實了該假說[14]。該結果也可以解釋日后生活中小窩喂養大鼠表現出一些交感神經興奮性增高有關的疾病如高血壓等。

本研究證實了早期肥胖能通過上調交感腎上腺系統的興奮性而加速雌鼠青春期啟動和影響其卵巢功能，為發育起源的疾病的預防和治療提供了研究基礎。

[1]Pelusi C, Pasquali R. Polycystic ovary syndrome in adolescents: pathophysiology and treatment implications [J]. Treat Endocrinol, 2003, 2(4): 215-230.

[2]Vicennati V, Ceroni L, Genghini S, et al. Sex difference in the relationship between hypothalamic-pituitary-adrenal axis and sex hormones in obesity[J]. Obesity (Silver Spring), 2006, 14(2): 235-243.

[3]Julio-Pieper M, Lara HE, Bravo JA, et al. Effects of nerve growth factor (NGF) on blood vessels area and expression of the angiogenic factors VEGF and TGFbeta 1 in the rat ovary [J]. Reprod Biol Endocrinol, 2006, 4(3): 57-67.

[4]Castellano JM, Roa J, Luque RM, et al. KiSS-1/kisspeptins and the metabolic control of reproduction: physiologic roles and putative physiopathological implications[J]. Peptides, 2009, 30(1): 139-145.

[5]Dorfman M, Ramirez VD, Stener-Victorin E, et al. Chronicintermittent cold stress in rats induces selective ovarian insulin resistance[J]. Biol Reprod, 2009, 80(2): 264-271.

[6]Morrison SF, Ramamurthy S, Young JB. Reduced rearing temperature augments responses in sympathetic outflow to brown adipose tissue[J]. J Neurosci, 2000, 20(2): 9264-9271.

[7]吳雪清, 李曉峰, 葉碧綠. 生命早期的免疫應激對雌鼠青春期生殖功能的影響[J]. 中華婦產科雜志, 2011, 46(6): 441-445.

[8]Young JB. Effects of neonatal handling on sympathoadrenal activity and body composition in adult male rats[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2000, 279(5): R1745-R1752.

[9]Vander Tuig JG, Knehans AW, Romsos DR. Lesions in the ventromedial hypothalamus (VMH) reduce sympathetic nervous system activity in rats (Abstract)[J]. Federation Proc, 1981, 40(11): 887.

[10]Tentolouris N, Liatis S, Katsilambros N. Sympathetic system activity in obesity and metabolic syndrome[J]. Ann NY Acad Sci,2006, 1083(11): 129-152.

[11]Seals DR, Bell C. Chronic sympathetic activation: consequence and cause of age-associated obesity?[J]. Diabetes, 2004, 53(2): 276-284.

[12]Carlyle M, Jones OB, Kuo JJ, et al. Chronic cardiovascular and renal actions of leptin: role of adrenergic activity[J]. Hypertension, 2002, 39(2 Pt 2): 496-501.

[13]Boullu-Ciocca S, Dutour A, Guillaume V, et al. Postnatal diet-induced obesity in rats upregulates systemic and adipose tissue glucocorticoid metabolism during development and in adulthood: its relationship with the metabolic syndrome[J]. Diabetes, 2005, 54(1): 197-203.

[14]Morris MJ, Velkoska E, Cole TJ. Central and peripheral contributions to obesity-associated hypertension: impact of early overnourishmen[J]. Exp Physiol, 2005, 90(5): 697-702.

（本文編輯：吳健敏）

Long-term programming effects of obesity on the sympathoadrenal system in female rats

WU Xueqing1,YANG Simeng1, LI Yuehua1, ZHOU Qiangyong1, CHEN Haiyan1, LI Haiying2.1.Department of Gynecology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of Cardiology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To investigate the long-term programming effects of obesity on the sympathoadrenal system in female rats.Methods:The litter size was adjusted to 4 pups per litter for the treatment group and 12 neonates per dam in the controls at postnatal day 0. Body weights were measured weekly. Vaginal opening and vaginal cytology smears were monitored from postnatal day 28. At the 10 weeks of age, the sympathetic nerve activity in adrenals and ovaries were detected by immunohistochemistry and the expression of TH mRNA in the locus coeruleus were investigated by in situ hybridization.Results:As compared to normal litters, the small litter rats were obesity throughout life. The puberty onsets were obviously advanced (35.5±0.8 d in treatment groups vs.37.6±0.3 d) in controls. The immuno-staining of TH were significantly enhanced in both the ovaries and adrenals in small litters. The level of TH mRNA in the locus coeruleus was significantly increased in small litters. All the differences were statistically significant (P<0.05).Conclusion:Obesity programmed the reproductive function of female rats by up-regulation of the sympathoadrenal system.

obesity; adrenal; ovary; reproductive function; sympathetic nerve; rats

R711

A

1000-2138（2014）03-0157-04

2013-11-25

國家自然科學基金資助項目（81100392）；浙江省自然科學基金資助項目（Y2110606）；教育部留學回國人員科研啟動基金資助項目（2012-1707）。

吳雪清（1971-），女，浙江溫州人，教授，博士。

李海鷹，主任醫師，Email：lihaiying111@gmail. com。