松弛素對TGF-β誘導的內皮細胞間質化的抑制作用

陳瀟，周浩，周希，蔡潔潔，陳靈芝，鄭高暑，黃偉劍，張懷勤

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 心內科，浙江 溫州 325015；2.溫州市中心醫院 檢驗科，浙江溫州 325000）

松弛素對TGF-β誘導的內皮細胞間質化的抑制作用

陳瀟1，周浩1，周希1，蔡潔潔1，陳靈芝2，鄭高暑1，黃偉劍1，張懷勤1

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 心內科，浙江 溫州 325015；2.溫州市中心醫院 檢驗科，浙江溫州 325000）

目的：探討松弛素（RLX）對TGF-β誘導的內皮細胞間質化現象的影響。方法：采用體外分離的人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）作為體外細胞模型，通過TGF-β10 ng/mL誘導內皮細胞間質化，100 ng/mL和200 ng/mL RLX分別預處理，再與TGF-β聯合培養48 h。光鏡下觀察細胞形態學改變，CCK-8實驗和transwell實驗檢測細胞增殖和遷移能力，免疫熒光單雙染技術觀察vimentin和CD31的表達變化，蛋白免疫印跡技術觀察各實驗組vimentin、CD31、ve-cadherin和α-SMA的蛋白表達。結果：陰性對照組內皮細胞呈鋪路石樣生長，TGF-β誘導組細胞形態向梭形轉化，呈擴散遷移趨勢。與陰性對照組相比，TGF-β誘導組細胞增殖、遷移能力明顯增強；而RLX可抑制TGF-β誘導的增殖和遷移。免疫熒光單染結果顯示，與陰性對照組相比，TGF-β誘導組內皮細胞特異性蛋白CD31表達下調而間質細胞標志性蛋白vimentin明顯上升；與TGF-β組相比，RLX聯合TGF-β處理組CD31表達上調而vimentin表達下調。免疫熒光雙染結果顯示，陰性對照組以內皮性質的細胞為主，僅存在少量的CD31和vimentin雙陽性細胞；TGF-β誘導組雙陽性細胞明顯增多；與TGF-β組相比，RLX聯合TGF-β處理組間質效應的雙陽性細胞下調，而內皮效應的雙陽性細胞增多。蛋白免疫印跡結果顯示，與陰性對照組相比，TGF-β誘導組內皮細胞特異性蛋白CD31（0.36± 0.076 vs 0.88±0.086）和ve-cadherin（0.54±0.046 vs 1.09±0.13）表達下調而間質細胞標志性蛋白vimentin（0.72±0.102 vs 0.21±0.081）和α-SMA（0.88±0.084 vs 0.24±0.046）明顯上升（P＜0.05）；與TGF-β組相比，RLX聯合TGF-β處理組CD31（0.67±0.09、0.59±0.12 vs 0.36±0.076）和ve-cadherin（0.85±0.09、0.72±0.064 vs 0.54±0.046）表達上調，而vimentin（0.56±0.011、0.48±0.06 vs 0.72±0.102）和α-SMA（0.65±0.081、0.54±0.032 vs 0.88±0.084）表達下降（P＜0.05），且呈劑量依賴性。結論：RLX可抑制TGF-β誘導的內皮細胞向間質化細胞轉化。

松弛素；內皮細胞間質化；TGF-β；心肌纖維化

心肌和大動脈壁纖維化是許多心臟疾病的基本表現，與疾病的發生發展及預后密切相關。抗纖維化已成為治療心腦血管疾病的重要靶點，而內皮細胞間質化是組織器官纖維化中成纖維細胞的重要來源，闡明并阻斷這一過程對防治纖維化有重要的臨床意義[1]。松弛素（RLX）屬胰島素類肽類激素，在研究妊娠期骨盆變化時被首次發現[2]，其可通過下調膠原生成和增加膠原降解發揮抗纖維化的作用。RLX可由心臟本身產生，主要通過與細胞表面的特異性受體LGR7或LGR8結合，介導Smad細胞間信號，激活特殊的基因，有心臟保護和細胞外基質調節作用[3]。本研究通過構建由TGF-β誘導的內皮細胞向間質化轉化的模型，由不同劑量的RLX進行預處理，探討RLX對TGF-β誘導的內皮細胞間質化現象的影響，以及對抗纖維化治療的展望。

1 材料和方法

1.1 實驗對象選用人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）。

1.2 實驗試劑和藥物Recombinant Human Relaxin-2（130-10）和TGF-β（100-21）購自peprotech公司；兔抗人ve-cadherin（D87F2）、兔抗人vimentin（D21H3）、鼠抗人CD31（89C2）購自Cell Signaling Technology公司；兔抗人Anti-Von Willebrand Factor antibody購自abcam公司；鼠抗人α-SMA購自武漢博士德生物工程有限公司；Alexa Fluor熒光二抗購自earthox公司；Hoechst 33342購自Sigma-Aldrich公司。

1.3 實驗分組實驗共分五組：①陰性對照組；②RLX對照組：RLX 100 ng/mL；③TGF-β誘導組：TGF-β10 ng/mL；④TGF-β+RLX 100 ng/mL處理組：先加入RLX 100 ng/mL培養24 h后加入TGF-β10 ng/ mL；⑤TGF-β+RLX 200 ng/mL處理組：先加入RLX 200 ng/mL 培養24 h后加入TGF-β10 ng/mL。以上每組均在37 ℃，5% CO2恒溫無菌的細胞培養箱中培養48 h。

1.4 HUVECs原代培養與簽定

1.4.1 HUVECs原代培養和分離：取新生兒臍帶，無夾痕扭曲部分，夾閉兩端后注入胰酶并置于37 ℃水浴箱中7～10 min。取臍帶內消化液離心后，取沉淀重懸，移至細胞培養瓶內。3～4 d長至70%～80%匯合后傳代，取4～6代細胞實驗。所用標本經醫院倫理委員會批準同意。

1.4.2 HUVECs細胞鑒定：制細胞爬片于24孔板上，固定封閉后加入兔抗人VWF相關抗原（1:160），4 ℃過夜后Hochest33342（1μ g/mL）染核20 min，熒光二抗（DyLight 488）孵育1 h。滴加抗熒光猝滅劑后在熒光顯微鏡下觀察。

1.5 增殖與遷移實驗

1.5.1 細胞增殖實驗：細胞按1×104/m2孔接種到96孔板，培養12 h后饑餓24 h。隨機分組，設4個復孔，按實驗分組繼續培養48 h后，每孔加入10μ L CCK-8試劑，37 ℃放置2.5 h。在酶標儀450 nm下讀取吸光度OD值。

1.5.2 細胞遷移實驗：細胞按5×104個/孔接種到24孔板，培養12 h后饑餓24 h。隨機分組，設3個復孔，按上述實驗分組繼續培養48 h后胰酶消化成5×104/mL單細胞懸液。在transwell小室的下室加入600μL含10% FBS的培養基，上室加入單細胞懸液100 μL。37 ℃培育24 h后多聚甲醛固定，結晶紫染色，計數。

1.6 免疫熒光技術

1.6.1 免疫熒光單染技術：制細胞爬片到24孔板上，隨機分組，設3個復孔，按上述實驗分組繼續培養48 h。固定封閉后加入各濃度一抗4 ℃過夜，VWF（1:150），vimentin（1:100），ve-cadherin（1: 100），CD31（1:1600），α-SMA（1:120）。次日Hochest33342（1μg/mL）染核20 min后加相應熒光二抗（DyLight 488/DyLight 594，1:300）室溫孵育1 h。滴加抗熒光淬滅劑后在熒光顯微鏡下觀察。

1.6.2 免疫熒光雙染技術：步驟同單染。CD31和vimentin混合一抗，200μ L/孔，各一抗濃度不變。

1.7 蛋白免疫印跡技術檢測蛋白含量提取細胞蛋白，測定蛋白濃度，恒質量上樣蛋白400μ g，配制10%的分離膠和3%的濃縮膠（SDS-PAGE），電泳，轉膜，封閉，加入一抗（1:1 000），4 ℃過夜（15 h），洗膜，加入辣根過氧化物酶標記二抗（1:5 000），室溫下孵育1 h，洗膜，曝光。Gelpro32分析軟件進行灰度值分析，以目的蛋白/內參蛋白表達的相對值進行統計學比較。

1.8 統計學處理方法采用SPSS19.0統計軟件。數據以±s表示，對各組數據先進行正態檢驗和方差齊性檢驗，若符合正態分布、方差齊，則進行單因素方差分析（One-way ANOVA），組間比較采用LSD檢驗；若不符合方差齊性的要求，則進行秩和檢驗，組間比較采用Mann-Whiteney法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 光鏡下HUVECs的形態學變化光鏡下HUVECs呈多邊形，邊界清楚，呈現集落式生長，TGF-β誘導48 h后，部分細胞形態轉變成梭形，細胞間隙增大，細胞向邊界擴散遷移，RLX聯合TGF-β則介于以上兩種形態之間，RLX可抑制內皮細胞向間質細胞的表型轉化，如圖1。

圖1 光鏡下細胞形態變化（×200 ）

2.2 原代HUVECs細胞鑒定第4代HUVECs細胞VWF相關抗原陽性率為（0.0957±0.03）%，見圖2。

圖2 第4代HUVECs細胞VWF相關抗原免疫熒光染色（×400）

2.3 增殖與遷移實驗結果

2.3.1 細胞增殖實驗：TGF-β誘導組較陰性對照組吸光度A值明顯降低（P＜0.05），表明TGF-β可促進HUVECs增殖；RLX聯合TGF-β處理組與TGF-β誘導組相比，吸光度值明顯升高（P＜0.05），表明RLX可抑制TGF-β誘導的增殖效應，見表1。

2.3.2 細胞遷移實驗：通過transwell法檢測，與陰性對照組相比，TGF-β誘導組穿膜細胞數明顯增多（P＜0.05）；與TGF-β誘導組相比，RLX聯合TGF-β處理組穿膜細胞數減少（P＜0.05），見表1。

表1 各組CCK-8實驗吸光度A值和穿膜細胞數（±s）

表1 各組CCK-8實驗吸光度A值和穿膜細胞數（±s）

與陰性對照組比：aP＜0.05；與TGF-β誘導組比：bP＜0.05

穿膜細胞數178.6±29.0 190.2±32.8 513.8±29.4a344.2±10.8b415.6±30.4b組別陰性對照組RLX對照組TGF-β誘導組TGF-β+RLX 100 ng/mL處理組TGF-β+RLX 200 ng/mL處理組A值1.17±0.06 1.37±0.02 0.85±0.04a1.16±0.03b1.19±0.04b

2.4 免疫熒光實驗結果

2.4.1 免疫熒光技術檢測vimentin和CD31單染：按實驗分組培養48 h后，與陰性對照組相比，TGF-β誘導組內皮細胞特異性蛋白CD31表達下降，而間質細胞特異性蛋白vimentin表達升高；與TGF-β誘導組相比，RLX聯合TGF-β處理組CD31升高而vimentin下降，見圖3-4。

2.4.2 免疫熒光雙染技術：對照組含極少的內皮、間質標志物雙陽性細胞，而TGF-β誘導組明顯增多；與TGF-β誘導組相比，RLX聯合TGF-β處理組間質效應的雙陽性細胞下降，而內皮效應的雙陽性細胞增多。見圖5。

2.5 蛋白免疫印跡技術檢測CD31、ve-cadherin、vimantin和α-SMA蛋白表達與陰性對照組相比，TGF-β誘導組內皮細胞特異性標志蛋白CD31（0.36 ±0.076 vs 0.88±0.086）和ve-cadherin（0.54 ±0.046 vs 1.09±0.13）表達下調而間質細胞標志性蛋白vimentin（0.72±0.102 vs 0.21±0.081）和α-SMA（0.88±0.084 vs 0.24±0.046）明顯上升（P＜0.05）；與TGF-β誘導組相比，RLX聯合TGF-β處理組CD31（0.67±0.09、0.59±0.12 vs 0.36±0.076）和ve-cadherin（0.85±0.09、0.72 ±0.064 vs 0.54±0.046）表達上調，而vimentin（0.56±0.011、0.48±0.06 vs 0.72±0.102）和α-SMA（0.65±0.081、0.54±0.032 vs 0.88 ±0.084）表達明顯下降（P＜0.05），且呈劑量依賴性。見圖6。

圖3 各組細胞免疫熒光顯微鏡下CD31表達（綠色熒光）（×400）

圖4 各組細胞免疫熒光顯微鏡下vimentin（綠色熒光）表達（×200）

圖5 各組細胞免疫熒光顯微鏡下vimentin（綠色熒光）和CD31（紅色熒光）表達（×400）

圖6 各實驗組CD31、ve-cadherin、vimantin和α-SMA蛋白表達變化

3 討論

成纖維細胞是心肌纖維化的主要效應細胞，其來源主要有損傷的組織內固有的成纖維細胞活化和血液中的骨髓間充質細胞[4]。但是，近年的研究發現，內皮細胞間質化是成纖維細胞的重要來源，是組織器官發生纖維化的重要機制，成人心血管系統在應激、創傷、炎癥等情況下也存在血管內皮細胞間質化現象，與心肌纖維化密切相關[5]。TGF-β是目前認為與心肌纖維化關系最密切的細胞因子，體內外實驗均報道TGF-β信號通路在內皮細胞間質化過程中起著重要作用[6]。本實驗采用體外分離的HUVECs作為血管內皮細胞的體外細胞模型，通過TGF-β誘導后，細胞由鋪路石樣形態向梭形形態轉化，細胞之間的連接減少，細胞間隙變大，細胞增殖和遷移能力明顯增加，同時，間質細胞特異性蛋白表達明顯增加，內皮細胞特異性蛋白和間質細胞特異性蛋白雙陽性細胞較對照組明顯增加。這些結果提示內皮細胞可向成纖維細胞轉化，內皮細胞是成纖維細胞的來源之一，而TGF-β可誘導內皮向間質化轉化的過程，因此通過阻斷這一過程將可能延緩和抑制纖維化的發生。

RLX最初被認為是一種與妊娠相關的激素，妊娠期間引起子宮和產道松弛舒張，其機制與降解細胞間質的膠原纖維含量相關[7]。近來的研究發現，RLX在心血管組織，如心肌細胞、血管平滑肌細胞和血管內皮功能上均有表達，心血管系統亦是RLX作用靶器官之一[3]，并且已證實其可阻斷心肌纖維化過程。動物實驗表明，RLX基因敲除小鼠心肌發生明顯的纖維化[8]，相反，外源性給予RLX干預可明顯抑制心肌纖維化模型小鼠心臟纖維含量的升高[9]。新近的臨床試驗表明RLX治療可以降低急性心力衰竭患者血壓，減輕呼吸困難癥狀，并有降低心血管和腎臟不良事件的趨勢[10]。綜上研究，RLX有望被用于人類心臟纖維化性疾病的治療。然而，目前RLX抗心臟纖維化作用的具體機制和信號通路尚不完全明確。本研究通過構建TGF-β誘導的內皮細胞間質化現象，應用RLX進行預處理，觀察RLX對內皮細胞間質化的抑制作用。結果顯示，RLX干預后，細胞由鋪路石樣形態向梭形形態轉化明顯減少，細胞間隙、細胞增殖和遷移較TGF-β誘導組明顯減少，同時間質細胞特異性表達蛋白減少，內皮細胞特異性蛋白和間質細胞特異性蛋白雙陽性細胞亦明顯減少，表明RLX可阻斷內皮細胞向間質細胞表型轉化，有效地抑制內皮細胞間質化。2007年Zeisberg等[1]動物實驗首次證明心肌纖維化與內皮細胞間質化現象的關系，冠狀動脈血管內皮細胞是成纖維細胞的來源之一，因此，我們認為RLX有望通過抑制內皮細胞間質化現象從而減輕心肌纖維化。

總之，RLX對心肌纖維化的治療前景已得到基礎研究和臨床試驗的肯定，但其機制尚未完全闡明。近年來的研究證實內皮細胞間質化是纖維化疾病的重要機制[11]，是成纖維細胞的重要來源。本實驗通過構建TGF-β誘導的內皮細胞間質化模型，闡明RLX對內皮細胞間質化的影響，旨在為心肌纖維化機制研究和RLX的臨床應用提供進一步的依據，但其具體的作用機制有待進一步探討。

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（本文編輯：吳健敏）

The inhibition effect of relaxin for TGF-β induced endothelial to mesenchymal transition in vitro

CHEN Xiao1, ZHOU Hao1, ZHOU Xi1, CAI Jiejie1, CHEN Lingzhi2, ZHENG Gaoshu1, HUANG Weijian1, ZHANG huaiqin1.1.Department of Cardiovascular, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Clinical laboratory, Wenzhou City Center Hospital, Wenzhou, 325000

Objective:To investgate the effect of relaxin which inducing endothelial to mesenchymal transition in vitro.Methods:Endothelial cells were isolated from human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). TGF-β10 ng/mL was added to medium for inducing endothelial to mesenchymal transition. Pretreatment relaxin 100 ng/mL and 200 ng/mL was added to medium, then co-cultured with TGF-β10 ng/mL for 48 h. The changes of morphology were observed under an inverted phase contrast microscope. CCK-8 assay was used to evaluate the cell proliferation as well as Transwell tested cell migration. The expression of CD31, vimentin, ve-cadherin and α-SMA were determined by immunofluoresence staining and western blot analysis. The co-expression of CD31 with vimentin and VWF withα-SMA were also determined by immunofluoresence.Results:A paving stone-like growth was observed in control group while TGF-β induced more spreading and migrating cells which was called EMT. However, this transition could be prevented by relaxin. Compared with the control group, the proliferation and the mobility were increased by TGF-β(P<0.05), but declined when combining with relaxin compared toadding TGF-β only (P<0.05). Compared with the control group, the specific protein of endothelial CD31 (0.36 ±0.076 VS 0.88±0.086) and ve-cadherin (0.54±0.046 VS 1.09±0.13) were significantly decreased when adding TGF-β, but the specific protein of mesenchymal vimentin (0.72±0.102 VS 0.21±0.081) and α-SMA (0.88±0.084 VS 0.24±0.046) were significantly increased. However, relaxin could inhibit the phenotype switch. Compared with the TGF-β inducing group, CD31 (0.67±0.09, 0.59±0.12 VS 0.36±0.076) and ve-cadherin(0.85±0.09, 0.72±0.064 VS 0.54±0.046) were significantly increased, but vimentin (0.56±0.011, 0.48±0.06 VS 0.72±0.102) and α-SMA (0.65±0.081, 0.54±0.032 VS 0.88±0.084) were significantly decreased when combining with relaxin. Besides, it exhibited dose-dependent. Last but not least, the number of double positive cells was largely increased in TGF-β inducing group compared to the control group. And compared with the TGF-β group, double positive cells performing mesenchymal are declined while performing endothelial ones are increased in the combined group.Conclusion:Relaxin exhibits the inhibition effect for TGF-β induced endothelial to mesenchymal transition in vitro.

relaxin; endothelial to mesenchymal transition; TGF-β; myocardial fibrosis

R329.2；R541

A

1000-2138（2014）03-0161-05

2013-11-28

浙江省自然科學基金資助項目（LY12H02004）。

陳瀟（1987-），女，浙江寧波人，碩士生。

張懷勤，主任醫師，碩士生導師，Email：zhanghuaiqin@126.com。